背景[1-3]
CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒是应用新型的水溶性四唑盐2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。
四唑盐在电子载体存在的情况下能够被线粒体内的一些脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的Formazan，生成的Formazan量与活细胞数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。
CCK-8细胞检测图
CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分，CCK-8溶液很稳定，对细胞没有毒性，可以长时间孵育细胞。CCK-8法测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的灵敏度高，无放射性，检测细胞增殖实验的灵敏度比其它方法如MTT,XTT,MTS和WST-1高。
使用步骤：
1、收集细胞，加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100ml培养基）。
2、置37℃，5%CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。
3、每孔加入10 ul待检测药物溶液，37℃孵育。
4、每孔加入10 ul CCK-8溶液，37℃孵育1-4小时。
5、同时设置空白孔（培养基和CCK-8溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和CCK-8溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。
应用[4][5]
用于子宫内膜癌DNA错配修复基因表达与顺铂敏感性相关性研究
1. 通过实时定量PCR及Western蛋白印迹检测子宫内膜癌细胞Ishikawa和R L95-2中MLH1、PMS2和MSH6在蛋白及基因水平的表达情况。
2. 通过CCK8细胞增殖-毒性实验和流式细胞术检测Ishikawa和RL95-2细胞对顺铂药物的敏感性。
方法:1.应用RT-PCR检测Ishikawa和RL95-2细胞中MLH1、PMS2、MSH6的基因表达水平。
2.应用Western blot法检测Ishikawa和RL95-2细胞中MLH1、PMS2、MSH 6的蛋白表达水平。
3. CCK8细胞增殖-毒性实验检测不同浓度顺铂处理的Ishikawa和RL95-2细胞活性,应用流式细胞术检测不同浓度顺铂处理后的Ishikawa和RL95-2细胞的凋亡率。研究子宫内膜癌细胞系Ishikawa和RL95-2对不同浓度顺铂药物的敏感性与错配修复基因表达之间的关系。
4. 应用GraphPad Prism 6.01版进行统计学分析。使用Student’s t检验分析两组或三组之间的差异。P值<0.05具有统计学意义。
研究结果:1.RL95-2细胞中MLHI,PMS2,MSH6呈高表达,Ishikawa细胞中MLH1,PMS 2,MSH6呈低表达,二者中MLH1、PMS2、MSH6的表达水平有显著差异,这种差异有统计学意义（P<0.05）。
2.CCK8细胞增殖-毒性实验检测到在相同的0,5,10,15,20,25umol顺铂化疗药物浓度梯度下Ishikawa和RL95-2细胞对顺铂的IC50值分别为2.5umol和82.6umol/ml（P<0.05）。二者间的差异有统计学意义,与Ishikawa相比,RL95-2细胞对顺铂药物的敏感性更高。
参考文献
[1]Efficacy of Adjuvant 5-Fluorouracil Therapy for Patients with EMAST-Positive Stage II/III Colorectal Cancer.Hamaya Y,Guarinos C,Tseng-Rogenski SS,Iwaizumi M,Das R,Jover R,Castells A,Llor X,Andreu M,Carethers JM.PLo S One.2015
[2]Selective recognition of a cisplatin-DNA adduct by human mismatch repair proteins.Yamada M,O’Regan E,Brown R,Karran P.Nucleic Acids Research.1997
[3]Structural effect of intra-strand cisplatin-crosslink on palindromic DNA sequences.van Boom S S,Yang D,Reedijk J,van der Marel G A,Wang A H.Journal of biomolecular structure&dynamics.1996
[4]Role of c-Abl kinase in DNA mismatch repair-dependent G 2 cell cycle checkpoint arrest responses.Wagner,Mark W,Long,Shan Li,Morales,Julio C,Galindo,Cristi L,Garner,Harold R,Bornmann,William G,Boothman,David A.Journal of Biological Chemistry.2008
[5]李越.子宫内膜癌DNA错配修复基因表达与顺铂敏感性相关性研究[D].山东大学,2019.