背景[1-3]
人胰岛素样生长因子(IGF)ELISA KIT采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清中IGF的含量测定。
实验原理：预先包被的抗体和检测相抗体都是亲和纯化的IGF多克隆抗体。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IGF呈正相关。
人胰岛素样生长因子(IGF)ELISA KIT
操作步骤：
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
应用[4][5]
用于人胰岛素样生长因子Ⅰ型在大肠杆菌和家蚕中的表达研究
人胰岛素样生长因子（hIGF-Ⅰ）是一个小分子多肽,具有多种生物学效应及临床应用价值。
本研究将hIGF-Ⅰ基因（588 bp）克隆进原核表达载体pET-28a（+）,在大肠杆菌中获得了与6×组氨酸的融合表达。Western blotting显示表达的hIGF-Ⅰ分子量约为26 kD,与理论值相符,表明hIGF-Ⅰ表达产物未经加工,表达产物中含有载体融合序列及基因中信号肽序列等编码的氨基酸序列。
将hIGF-Ⅰ全cDNA基因克隆进pBacPAK8,获得了杆状病毒转移载体pBacPAK8-IGF-Ⅰ,在脂质体的介导下,与线性化的家蚕杆状病毒共转染家蚕培养细胞BmN,经空斑筛选,PCR检测,获得了重组病毒BmNPV-IGF-Ⅰ。SDS-PAGE检测表明,在感染重组病毒后,家蚕幼虫血淋巴中可以检测到两条分子量约为7.5 kD和22 kD的特异性条带,ELISA检测表达量达4.51μg/mL蚕血淋巴。
在家蚕中表达的蛋白中,分子量约为7.5 kD的表达产物,与加工完善的hIGF-Ⅰ分子量一致（70个氨基酸）,表明来源于真核生物的人hIGF-Ⅰ基因的信号肽也可能在家蚕杆状病毒表达系统中得到正确识别与加工;另外在感染后期,可见有一约22 kD的表达产物特异条带,与hIGF-Ⅰ完整基因推测的蛋白质分子量理论值相符,推测该产物可能未经成熟作用而保留了信号肽序列和C端部分序列。
参考文献
[1]Induction of T cell response by bluetongue virus core-like particles expressing a T cell epitope of the M1 protein of influenza A virus[J].Sabine Adler,Paul Reay,Polly Roy,H.-D.Klenk.Medical Microbiology and Immunology.1998(2)
[2]N-glycosylation of a baculovirus-expressed recombinant glycoprotein in three insect cell lines[J].P.C.Kulakosky,M.L.Shuler,H.A.Wood.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal.1998(2)
[3]Articular cartilage destruction in experimental inflammatory arthritis:insulin-like growth factor-1 regulation of proteoglycan metabolism in chrondrocytes[J].Pernette J.Verschure,Cornelis J.F.Noorden,Jan Marle,Wim B.Berg.The Histochemical Journal.1996(12)
[4]Foreign gene expression in Hansenula polymorpha.A system for the synthesis of small functional peptides[J].K.N.Faber,S.Westra,H.R.Waterham,I.Keizer-Gunnink,W.Harder,G.AB,M.Veenhuis.Applied Microbiology and Biotechnology.1996(1)
[5]徐岩.人胰岛素样生长因子Ⅰ型在大肠杆菌和家蚕中的表达[D].苏州大学,2006.