背景[1-3]
T-47D细胞分离自一位54岁乳房侵入性导管癌的女性患者胸水；发现分化的上皮亚株(T-47D)有细胞质连接和17-β-雌二醇及其他类固醇降血钙素的受体，T-47D细胞表达WNT7B癌基因。T-47D生长培养基：RPMI-1640＋0.2U/ml Insulin＋10%FBS＋1%P/S，培养条件气相：空气，95%；CO2，5%。
T-47D细胞
细胞复苏步骤：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
细胞传代步骤：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于温化胶囊对人乳腺癌MCF-7和T-47D细胞株细胞增殖和细胞周期的影响研究
究温化胶囊对人乳腺癌MCF-7和T-47D细胞株细胞增殖和细胞周期的影响。方法:实验分四个阶段进行。
阶段,使用高效液相色谱法对温化胶囊进行指纹图谱分析,并以乌头碱标准品为对照定量分析温化胶囊所含乌头碱;
第二阶段,对MCF-7和T-47D细胞株进行体外细胞培养,设立空白对照组、75μg/ml温化胶囊组及250μg/ml温化胶囊组3组,观察7天,绘制生长曲线,采用重复测量的方差分析法对细胞生长曲线进行线间比较。利用倒置相差显微镜观察两细胞株加药前后的形态学改变。
第三阶段,使用流式细胞仪分析温化胶囊对MCF-7和T-47D细胞株细胞周期的影响。
第四阶段,研究温化胶囊联合5-Fu对MCF-7和T-47D细胞增殖的影响。常规培养细胞,分6组进行实验:空白对照组、75μg/ml温化胶囊组、250μg/ml温化胶囊组、1μg/ml 5-Fu组、75μg/ml温化胶囊联合1μg/ml 5-Fu组、250μg/ml温化胶囊温化胶囊联合1μg/ml 5-Fu组,绘制生长曲线,计算细胞倍增时间。通过计算死亡细胞比例比较6组间细胞毒作用的强弱。
结果:绘制出温化胶囊高效液相色谱指纹图谱,测得温化胶囊乌头碱含量为1.01±0.01μg。温化胶囊对MCF-7和T-47D细胞具有增殖抑制作用,其作用的强度与药物剂量呈正相关。
细胞形态学观察发现,加入温化胶囊后两种细胞株的细胞质内均出现空泡样结构。随着药物作用时间的延长,空泡样结构的数量进行性增加,并可融合成大泡。流式细胞仪检查显示:与对照组相比,加药后S期细胞的比例显著升高。
参考文献
[1]Hallmarks of Cancer:The Next Generation[J].Douglas Hanahan,Robert A.Weinberg.Cell.2011(5)
[2]CCL2 increases MMP-9 expression and cell motility in human chondrosarcoma cells via the Ras/Raf/MEK/ERK/NF-κB signaling pathway[J].Chih-Hsin Tang,Chia-Chun Tsai.Biochemical Pharmacology.2011(3)
[3]Neurokinin‐1 receptor:functional significance in the immune system in reference to selected infections and inflammation[J].Steven D.Douglas,Susan E.Leeman.Annals of the New York Academy of Sciences.2011(1)
[4]Substance P inhibits natural killer cell cytotoxicity through the neurokinin‐1 receptor[J].Linda Monaco‐Shawver,Lynnae Schwartz,Florin Tuluc,Chang‐Jiang Guo,Jian Ping Lai,Satya M.Gunnam,Laurie E.Kilpatrick,Pinaki P.Banerjee,Steven D.Douglas,Jordan S.Orange.Journal of Leukocyte Biology.2011(1)
[5]闫祝辰.温化胶囊对人乳腺癌MCF-7和T-47D细胞株细胞增殖和细胞周期的影响[D].天津医科大学,2006.