背景[1-3]
人蛋白激酶C(PKC)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）检测样本中人蛋白激酶C(PKC)的含量。
检测原理：
往预先包被人蛋白激酶C（PKC）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人蛋白激酶C（PKC）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品活性。
人蛋白激酶C(PKC)ELISA KIT
样品收集、处理及保存方法
1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
操作步骤
1. 从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；
4. 随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于新奇型蛋白激酶C在低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用和机制研究
低氧对肺动脉平滑肌细胞增殖和新奇型蛋白激酶C表达的影响目的:1.明确低氧对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。2.明确低氧对肺动脉平滑肌细胞中新奇型蛋白激酶C表达的影响。
方法:1.磁性分离法分离健康成年的C57BL/6J小鼠的原代肺动脉平滑肌细胞,经体外培养传代至细胞稳定生长。
2. 选取生长状态良好的小鼠肺动脉平滑肌细胞,按照不同的低氧处理时间,将细胞分为低氧24h组、48h组、72h组并且每组均设置常氧对照组。CCK-8法、Brdu法检测各组细胞的增殖率。
3. 选取生长状态良好的小鼠肺动脉平滑肌细胞,按照不同低氧处理时间,将细胞分为低氧0h组、24h组、48h组、72h组,流式细胞术、Western blot检测不同低氧诱导时间下PKCδ、PKCε、PKCε、PKCζ四种不同的PKC的表达情况。
4. 对各组实验结果进行数据整理和统计学分析。
结果:1.低氧可以促进肺动脉平滑肌细胞增殖。由CCK-8检测结果可知,低氧24h组与常氧24h组的细胞存活率无明显差别（P>0.05）,同样低氧48h组与常氧48h组的细胞存活率也无明显差别（P>0.05）。但是低氧72h组相比于常氧72h组的细胞存活率有明显的提高（P<0.05）。由Brdu检测细胞增殖结果可知,低氧24h组与常氧24h组相比无明显差别（P>0.05）,低氧48h组与常氧48h组的细胞存活率有提高（P<0.05）。低氧72h组相比于常氧72h组的细胞存活率有明显的提高（P<0.05）。CCK-8与Brdu的结果一致,可见低氧可以促进肺动脉平滑肌细胞的增殖且低氧诱导72h时肺动脉平滑肌细胞的增殖效果显著增加,所以选取低氧诱导72h作为后续实验条件。
2.低氧可以诱导肺动脉平滑肌细胞中PKCδ、PKCε表达的上调。由流式细胞术检测结果可知,PKCδ、PKCε在低氧72h时的表达情况显著提高（P<0.05）而PKCε、PKCζ在低氧72h时的表达无显著差异（P>0.05）。Western blot检测结果同样显示PKCδ、PKCε在低氧72h时的表达情况显著提高（P<0.05）而PKCε、PKCζ在低氧72h时的表达无显著差异（P>0.05）。由以上两种结果可知,在肺动脉平滑肌细胞中,低氧可以诱导肺动脉平滑肌细胞中PKCδ、PKCε表达的上调而PKCε、PKCζ的表达无明显变化。
参考文献
[1]STIM2（Stromal Interaction Molecule 2）–Mediated Increase in Resting Cytosolic Free Ca2+Concentration Stimulates PASMC Proliferation in Pulmonary Arterial Hypertension[J].Shanshan Song,Shane G.Carr,Kimberly M.McDermott,Marisela Rodriguez,Aleksandra Babicheva,Angela Balistrieri,Ramon J.Ayon,Jian Wang,Ayako Makino,Jason X.-J.Yuan.Hypertension.2018(3)
[2]The Hypoxia-Adenosine Link during Intestinal Inflammation.[J].Bowser Jessica L,Phan Luan H,Eltzschig Holger K.Journal of immunology（Baltimore,Md.:1950）.2018(3)
[3]Protein kinase C isoforms in the normal pancreas and in pancreatic disease[J].Alicia K.Fleming,Peter Storz.Cellular Signalling.2017
[4]MitoKATP channels promote the proliferation of hypoxic human pulmonaryartery smooth muscle cells via the ROS/HIF/miR?210/ISCU signaling pathway[J].Hongling Hu,Yu Ding,Yang Wang,Shuang Geng,Jue Liu,Jinrong He,Yang Lu,Xueying Li,Mingli Yuan,Shan Zhu,Su Zhao.Experimental and Therapeutic Medicine.2017(6)
[5]蒋蕊.新奇型蛋白激酶C在低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用和机制研究[D].山西医科大学,2018.