背景[1-3]
KP-N-NS细胞源自脑转移灶的肾上腺神经母细胞瘤，培养条件：RPMI-1640(GIBCO，添加NaHCO3 1.5g/L，glucose 2.5g/L，Sodium Pyruvate 0.11g/L)，90%；胎牛血清，10%。气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度。
KP-N-NS细胞
细胞接收后的处理：
1）收到细胞后，请检查是否漏液，如果漏液，请拍照片发给我们。
2）请先在显微镜下确认细胞生长状态，去掉封口膜并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。
3）弃去T25瓶中的培养基，添加6ml新的完全培养基。
4）如果细胞长满（90%以上）请及时进行细胞传代。
细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
应用[4][5]
用于裸鼠皮下移植人神经母细胞瘤模型的建立和HIF-1α及其相关蛋白的表达研究
利用人肾上腺神经母细胞瘤细胞株建立裸鼠皮下移植人神经母细胞瘤模型,并探讨神经母细胞瘤中HIF-1α、VEGF、TGF-α等的表达情况,了解他们在肿瘤与正常组织中表达的差异,旨在了解缺氧诱导因子及其相关蛋白在神经母细胞瘤的发生发展中的作用,探讨其与肿瘤的临床病理、预后的关系,为NB的发病机理研究和诊治提供新的思路与方法。
方法应用KP-N-NS人肾上腺神经母细胞瘤细胞株建立裸小鼠皮下移植瘤模型40只,作为肿瘤组；阳性对照组选取手术切除的神经母细胞瘤肿瘤标本；阴性对照组选取正常人肾上腺髓质组织。
采用Envision免疫组织化学方法检测各组组织中HIF-1α、VEGF及TGF-α的表达情况,并对试验结果进行统计学处理。结合免疫组化结果将肿瘤组分为HIF-1α阳性组与HIF-1α阴性组,对两组的生存情况（体重变化、瘤体重量、存活天数）进行比较,并对试验结果进行统计学处理。
结果4周后解剖结果证实成模率80%；HIF-1α及其相关蛋白的阳性表达均主要表现为细胞核及细胞质内棕黄色颗粒；肿瘤组、阳性对照组与正常组HIF-1α、VEGF、TGF-α阳性表达率分别为73.70%±10.68%、69.80%±9.91%、71.43%±8.52%,70.35%±13.09%、67.45%±9.91%、70.30%±9.86%和9.67%±4.53%、6.80%±3.40%、6.50%±4.44%,三种蛋白在肿瘤组织与正常组织中的表达差异具有显著性（P<0.01）,肿瘤组与阳性对照组HIF-1α,VEGF、TGF-α三种蛋白的IOD（阳性染色的积分光密度）值分别为141.97±7.98、151.85±14.35、139.94±4.50,141.34±6.44、144.06±8.51、149.00±13.63,均明显高于阴性对照组,p<0.0l。HIF-lα在肿瘤组与阳性对照组中的表达与VEGF的表达成正相关（χ2=7.778r=0.504 P<0.01）,HIF-1α在肿瘤组与阳性对照组中的表达与TGF-α的表达无明显相关性（χ2=0.208 P=0.934 P>0.05）；
HIF-1α阳性组与HIF-1α阴性组体重变化、瘤体重量及存活天数比较t值分别为：-3.43、3.69、4.30,P值均小于0.01。
通过分析肿瘤组40例裸鼠生存时间与HIF-1α表达水平的关系发现,HIF-1α阴性组中位生存时间为24天,最长生存时间为33天；HIF-1α阳性组中位生存时间为17天,最长生存时间为22天；生存时间分别用LogRank,Breslow,Tarone-Ware检验,P值均小于0.05。
参考文献
[1]Regulation of angiogenesis by hypoxia-inducible factor 1[J].Kiichi Hirota,Gregg L.Semenza.Critical Reviews in Oncology and Hematology.2006(1)
[2]CoCl2,a Chemical Inducer of Hypoxia‐Inducible Factor‐1,and Hypoxia Reduce Apoptotic Cell Death in Hepatoma Cell Line HepG2[J].JEAN‐PASCALPIRET,DENISMOTTET,MARTINERAES,CARINEMICHIELS.Annals of the New York Academy of Sciences.2006(1)
[3]A Radicicol Derivative,KF58333,Inhibits Expression of Hypoxia‐inducible Factor‐1αand Vascular Endothelial Growth Factor,Angiogenesis and Growth of Human Breast Cancer Xenografts[J].JunichiKurebayashi,TakemiOtsuki,MasafumiKurosumi,ShiroSoga,ShiroAkinaga,HiroshiSonoo.Cancer Science.2005(12)
[4]Pleiotropic effects of HIF-1 blockade on tumor radiosensitivity[J].Benjamin J.Moeller,Matthew R.Dreher,Zahid N.Rabbani,Thies Schroeder,Yiting Cao,Chuan Y.Li,Mark W.Dewhirst.Cancer Cell.2005(2)
[5]孟庆磊.裸鼠皮下移植人神经母细胞瘤模型的建立和HIF-1α及其相关蛋白的表达[D].郑州大学,2011.