背景[1-3]
NCI-H23人非小细胞肺癌细胞源于一位51岁患有非小细胞肺癌黑人男性患者的治疗前的肿瘤组织，表达C-myc、L-myc、v-src、v-abl、v-erb B、c-raf 1、Ha-ras、Ki-ras、N-ras RNAs；该细胞携带K-ras 12突变；p53基因246位密码子突变ATC→ATG；表达PDGF A和B链的异源mRNA；表达TGFα、TGFβ和EGFR；角蛋白5、8和18阳性，波形蛋白阳性，神经丝蛋白阴性，左旋多巴脱氢酶阴性；据报道，在软琼脂中该细胞形成克隆的效率为9.7%。
NCI-H23人非小细胞肺癌细胞
细胞培养步骤
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；+1%Glutamax+1%Sodium Pyruvate，双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
应用[4][5]
用于10-羟基癸烯酸对肺癌A549细胞诱导凋亡作用及抑制迁移作用的研究
采用乙醇提取法确定从蜂王浆中提取10-HDA的工艺参数;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测10-HDA对人三种肺癌细胞（A549、NCI-H460、NCI-H23）的杀伤作用和对三种正常细胞（IMR-90、L-02、GES-1）的毒副作用;采用Hochest 33342/PI双染后荧光显微镜观察法及流式细胞术检测10-HDA对肺癌细胞的诱导凋亡作用;
采用流式细胞术检测10-HDA对肺癌细胞内活性氧（ROS）水平的调控作用及对肺癌细胞周期阻滞作用;采用细胞划痕法检测10-HDA对肺癌细胞迁移的抑制作用;采用蛋白质免疫印迹法检测10-HDA对肺癌细胞凋亡、周期、迁移及信号通路相关蛋白表达量的变化情况。
结果显示,乙醇提取法提取10-HDA的工艺参数为料液比1:6、乙醇浓度90%、萃取次数2次,提取率可达到3.316%;经过细胞实验,与阳性对照5-FU组相比,10-HDA对人三种肺癌细胞具有杀伤作用,且对三种正常细胞没有明显的毒副作用;
10-HDA通过下调肺癌A549细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2/BAX的比例,细胞内线粒体膜电位下降,引发caspase级联反应,从而诱导肺癌A549细胞发生线粒体依赖性凋亡;10-HDA通过上调细胞内ROS水平,激活JNK、p38信号通路,抑制ERK、STAT3和NF-κB信号通路,使caspase-3蛋白表达含量增加,从而诱导肺癌A549细胞发生线粒体依赖性凋亡;
11-10-HDA通过上调细胞内ROS水平,抑制AKT信号通路的过度激活,增加p21和p27的蛋白表达量,降低Cyclin D1/E与CDK2/4/6的蛋白表达量,使细胞周期阻滞在G0/G1期;10-HDA可以显著下调TGF-β1、SNAI1、GSK-3β、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达量,上调E-cadherin的蛋白表达量,抑制TGF-β信号通路的激活,阻滞EMT的发生,从而抑制肺癌A549细胞迁移。
综上所述,总结出了乙醇提取法提取10-HDA的工艺参数。同时总结出10-HDA对肺癌A549细胞诱导凋亡作用及抑制迁移作用的主要机制。
参考文献
[1]Dioscin facilitates ROS-induced apoptosis via the p38-MAPK/HSP27-mediated pathways in lung squamous cell carcinoma.[J].International journal of biological sciences.2020(15)
[2]ERK/MAPK signalling pathway and tumorigenesis.[J].Guo Yan-Jun,Pan Wei-Wei,Liu Sheng-Bing,Shen Zhong-Fei,Xu Ying,Hu Ling-Ling.Experimental and therapeutic medicine.2020(3)
[3]Transforming growth factor-β1 enhances proliferative and metastatic potential by up-regulating lymphoid enhancer-binding factor 1/integrinαMβ2 in human renal cell carcinoma.[J].Liu Yuting,Shang Donghao.Molecular and cellular biochemistry.2020(1-2)
[4]Solvent fractions of fermented Trapa japonica fruit extract stimulate collagen synthesis through TGF-β1/GSK-3β/β-catenin pathway in human dermal fibroblasts.[J].Nam Gun-He,Kawk Hye Won,Kim Sang-Yong,Kim Young-Min.Journal of cosmetic dermatology.2020(1)
[5]林欣梅.10-羟基癸烯酸对肺癌A549细胞诱导凋亡作用及抑制迁移作用的研究[D].黑龙江八一农垦大学,2021.