背景[1-3]
小鼠神经母细胞瘤细胞该细胞由Klebe RJ和Ruddle FH建立，来源于Albino A系小鼠的自发神经母细胞瘤；可产生大量的微管蛋白，该蛋白在对神经细胞的轴浆流动起主要作用的收缩系统中发挥重要作用。该细胞可用于研究长春新碱沉淀微管蛋白的机制、GTP与分离蛋白结合的动力学、体内微管蛋白的流动和微管蛋白的合成与聚集。OIE组织用该细胞做狂犬病的常规诊断。鼠痘病毒阴性。
小鼠神经母细胞瘤细胞
细胞培养操作规程：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基，90%；优质胎牛血清，10%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于脑红蛋白对小鼠神经母细胞瘤细胞系生长速度的影响研究
脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）过去被认为在神经元细胞的特异性表达,然而现在在多种肿瘤细胞中也被发现存在表达。这说明Ngb除了参与低氧调节和保护神经元及脑组织免于缺血缺氧性损伤外,可能在肿瘤的发生、形成和代谢中也发挥了作用。然而,另两个球蛋白家族的成员,肌红蛋白（myoglobin,Mb）和细胞红蛋白（cytoglobin,Cygb）已被多次报道参与了肿瘤的形成。其可能机制包括清除氧氮自由基,通过调节低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）表达,参与低氧环境下的适应,以及增加线粒体膜的稳定性。这些过程说明球蛋白家族或多或少通过和细胞色素c之间的某种联系,参与干扰细胞凋亡途径。
通过探讨Ngb是否在脑肿瘤细胞系中存在表达,并结合慢病毒载体介导,上调小鼠神经母细胞瘤细胞系N2a内Ngb的表达,来研究Ngb过表达状态下细胞的生长和增殖情况,为将来深入其机制的研究奠定基础,为Ngb在脑血管病的神经保护治疗中的应用提供保障。
方法1.通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）、细胞免疫荧光、Western Blot的方法,检查Ngb在小鼠神经母细胞瘤细胞系（N2a）、人类星形胶质细胞瘤细胞系（U251）、大鼠神经胶质瘤细胞系（C6）中的表达情况。
2. 将包装好的Ngb过表达慢病毒导入N2a细胞,上调其表达。表达产物通过Western Blot鉴定,并进行进一步实验去观察处理组和对照组之间细胞的增殖情况,包括细胞活力检测和克隆形成试验。
结果1.通过RT-PCR、免疫荧光检查和Western Blot,表明Ngb在神经母细胞瘤细胞系（N2a）与脑胶质瘤细胞系（U251、C6）均有表达。
2.感染Lenti-Ngb-GFP组的Ngb表达较对照组和Lenti-GFP组显著升高。
3.Lenti-Ngb-GFP感染组从第六天起细胞增值速度明显快于其他组（P<0.01）。在相同环境培养14天后,慢病毒感染组和对照组在克隆数量上未见差异。然而Lenti-Ngb-GFP组形成的细胞克隆平均大于Lenti-GFP组和对照组（P<0.05）。
结论1.通过RT-PCR、细胞免疫荧光的方法证实Ngb在多种脑肿瘤细胞系中存在表达。
2.通过使用Lenti-Ngb-GFP感染N2a细胞,成功上调了N2a细胞内Ngb的表达。
3.通过细胞增殖试验和平板克隆形成试验,证实Ngb表达上调可以加速肿瘤细胞的生长。
参考文献
[1]Myoglobin expression in renal cell carcinoma is regulated by hypoxia[J].C.L.Behnes,J.Bedke,S.Schneider,S.Küffer,A.Strauss,F.Bremmer,P.Str?bel,H.J.Radzun.Experimental and Molecular Pathology.2013(3)
[2]Cytoglobin has bimodal:tumour suppressor and oncogene functions in lung cancer cell lines[J].Urszula Oleksiewicz,Triantafillos Liloglou,Kalliopi-Maria Tasopoulou,Nikoleta Daskoulidou,Julie Bryan,John R.Gosney,John K.Field,George Xinarianos.Human Molecular Genetics.2013(16)
[3]HIF expression and the role of hypoxic microenvironments within primary tumours as protective sites driving cancer stem cell renewal and metastatic progression[J].Beatrice Philip,Koichi Ito,Rafael Moreno-Sánchez,Stephen J.Ralph.Carcinogenesis.2013(8)
[4]Mitochondrial Mechanisms of Neuroglobin’s Neuroprotection[J].Zhanyang Yu,Jessica L.Poppe,Xiaoying Wang,Grzegorz A.Czapski.Oxidative Medicine and Cellular Longevity.2013
[5]胡婧婧.脑红蛋白对小鼠神经母细胞瘤细胞系生长速度的影响[D].福建医科大学,2015.