背景[1-3]
谷氨酰胺酶抗体是一类可以特异性结合谷氨酰胺酶的多克隆抗体，主要用于体外谷氨酰胺酶的免疫学检测实验。
谷氨酰胺酶（glutaminase）是一种催化L-β-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨的反应的酶。谷氨酰胺酶（glutaminase）是酰胺酶的一种。在某些细菌、植物根中也含有此酶，但在高等动物中此酶的活性强。在动物肾脏和肝脏的酶，最适pH为8.0，在脑皮质和网膜的酶，最适pH为8—9，在性质上有差异。
取自大肠杆菌的酶，pH为4.7—5.1。此酶可受谷氨酸的阻抑，并且具有可被磷酸盐活化的和不活化的二种。在生物体内其从末梢组织转移来的谷氨酰胺生成的氨，具有调节体内碱贮（肾脏）和尿素的合成（肝脏）作用。
谷氨酰胺酶抗体免疫组化
血液中高水平谷氨酰胺浓度提供了一个现成的碳、氮源，用于支持癌细胞的生物合成、能量代谢和细胞内稳态，促进肿瘤的生长。
谷氨酰胺通过细胞中的转运蛋白SLC1A5(溶质载体家族1中性氨基酸转运蛋白成员5)运送到细胞中。
在营养匮乏的条件下，癌细胞可以通过分解大分子获得谷氨酰胺。致癌基因RAS过度激活可以促进胞饮作用，癌细胞清除胞外蛋白，降解为包括谷氨酰胺在内的氨基酸，为癌细胞提供营养物质。
癌细胞吸收大量的葡萄糖，但大部分的碳源通过有氧糖酵解作用都生成了乳酸，而不是用于TCA循环中。
过度激活PI3K、Akt、mTOR、KRAS基因或MYC通路的肿瘤细胞，通过谷氨酸酶(GLUD)或者转氨酶的催化，刺激谷氨酸代谢生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸进入三羧酸(TCA)循环，可以为细胞提供能量。
应用[4][5]
用于谷氨酰胺酶的表达、酶学性质研究及发酵优化研究
将四个不同来源的谷氨酰胺酶基因glsB、ylaM、ybgJ和Mglu分别在大肠杆菌BL21或枯草芽孢杆菌168中进行表达,考察它们的酶学性质和表达情况,比较分析获得一株合适的重组菌并对其进行发酵优化,提高重组菌中谷氨酰胺酶的表达。
（1）分别对四个不同来源的谷氨酰胺酶基因glsB、ylaM、ybgJ和Mglu进行克隆并构建六个重组菌体E.coli BL21/pET28a-glsB、E.coli BL21/pET28a-ylaM、E.coli BL21/pET28a-ybgJ、E.coli BL21/pET28a-Mglu、B.subtilis 168/pMA5-ylaM和B.subtilis 168/pMA5-Mglu。重组菌所产谷氨酰胺酶酶活力大小分别为58.91±1.34 U·m L-1、16.43±2.47U·m L-1、41.59±2.71 U·mL-1、30.37±1.03 U·m L-1、7.322±0.75 U·mL-1和32.67±2.21 U·m L-1,原始菌E.coli BL21和B.subtilis 168谷氨酰胺酶酶活力大小为0.03 U·m L-1和0.07U·m L-1。相比原始菌,重组菌的谷氨酰胺酶产量均得到了提高。
（2）分别对E.coli BL21/pET28a-glsB、E.coli BL21/pET28a-ylaM、E.coli BL21/pET28a-ybgJ和E.coli BL21/pET28a-Mglu谷氨酰胺酶进行分离纯化,纯化后的重组谷氨酰胺酶比酶活分别为2465 U·mg-1、939.5 U·mg-1、1005 U·mg-1和1326 U·mg-1;重组酶最适反应pH均为7.5,在pH 7.0-8.0之间较稳定;重组酶最适反应温度分别为55°C、45°C、55°C和50°C,E.coli BL21/pET28a-ylaM和E.coli BL21/pET28a-Mglu谷氨酰胺酶在25°C以下比较稳定,E.coli BL21/pET28a-glsB和E.coli BL21/p ET28a-ybgJ谷氨酰胺酶在35°C以下比较稳定;一价金属离子和EDTA对重组谷氨酰胺酶酶活影响不大,部分二价金属离子对重组酶酶活具有促进作用,大多数三价金属离子对重组酶酶活具有抑制作用;E.coli BL21/pET28a-glsB和E.coli BL21/pET28a-ybgJ谷氨酰胺酶在15-17.5%的盐浓度下基本失活,E.coli BL21/pET28a-yla M和E.coli BL21/pET28a-Mglu谷氨酰胺酶在15-17.5%的盐浓度下,谷氨酰胺酶残余酶活分别50.4%和77.4%以上,且E.coli BL21/pET28a-Mglu谷氨酰胺酶在高浓度盐条件下更稳定。
（3）综合重组酶的表达、酶学性质及菌种安全等因素考虑,选取B.subtilis168/pMA5-Mglu作为重组谷氨酰胺酶生产菌株,对其发酵培养基进行单因素优化,优化后的培养基为（g·L-1）:葡萄糖25,安琪酵母40,氯化铵4,L-谷氨酸钠2,磷酸二氢钾1.125,三水合磷酸氢二钾1.875,氯化钙2。在上述优化的培养基基础上,进行发酵条件优化,发酵的条件为:培养基最适初始pH 7.0,发酵最适温度24°C,最适培养转速180 r·min-1,菌种的最适接种量为4%（v/v）。在此基础上,重组菌B.subtilis168/pMA5-Mglu所产最高谷氨酰胺酶酶活可达到249.24±13.12 U·m L-1。
参考文献
[1]Purification and characterization of extracellular glutaminase from Aspergillus oryzae NRRL 32567[J].Wael Bazaraa,Ahmed Alian,Nagwa El-Shimi,Reda Mohamed.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology.2016
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[3]Biochemical Characterization and Antitumor Study of l-Glutaminase from Bacillus cereus MTCC 1305[J].P.Singh,R.M.Banik.Applied Biochemistry and Biotechnology.2013(2)
[4]Optimization of cultural conditions using response surface methodology versus artificial neural network and modeling of l-glutaminase production by Bacillus cereus MTCC 1305[J].Priyanka Singh,Shailendra Singh Shera,Jaba Banik,Rathindra Mohan Banik.Bioresource Technology.2013
[5]张美丹.谷氨酰胺酶的表达、酶学性质研究及发酵优化[D].江南大学,2017.