背景[1-3]
HACAT细胞源自一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外围正常皮肤，角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋白阳性。
HACAT细胞
HaCaT人永生化纤维细胞培养操作
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
用于清热活血解毒法调控HaCat细胞PI3K/Akt信号通路的机制研究
应用TNF-α活化HaCat细胞24小时,再添加PI3K/Akt信号通路的特异性阻滞剂LY294002干预1小时,制备实验所需的细胞模型。观察清热活血解毒复方及中药单体落新妇苷对经TNF-α活化的HaCat细胞的生物学行为影响,及PI3K/Akt信号通路对其的调控作用。
包括采用CCK-8法检测清热活血解毒复方及落新妇苷干预经TNF-α活化的HaCat细胞的增殖情况；应用蛋白质印迹法（、Vestern blotting）及RT-PCR检测信号通路蛋白Akt及CREB的表达,以及凋亡基因bax、bcl-xl及c-fos的表达；采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）分析细胞各周期分布情况及细胞凋亡率；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的分泌。
清热活血解毒复方能够抑制PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白及基因的表达,并且在Akt蛋白的抑制中呈现剂量依赖；信号通路被阻滞后,抑制作用虽仍然存在,但与通路阻断前相比,差异已无统计学意义。
同时,清热活血解毒复方对CREB蛋白及基因的表达均有明显抑制作用,且随着剂量的增加而增强,尤其是在应用高剂量（30mg/ml）时：信号通路被阻滞后,复方对CREB的抑制作用较阻断前有所减弱。
清热活血解毒复方对经TNF-α活化的HaCat细胞具有良好的抑制增殖作用；在信号通路被阻断后,细胞的增殖继续受到抑制。清热活血解毒复方对TNF-α舌化的HaCat细胞凋亡的影响主要表现在促进其早期凋亡；通路被阻断后,复方可使HaCat细胞的早期凋亡率继续上升,晚期凋亡率下降。
清热活血解毒复方可使HaCat细胞大量阻滞于S期而无法进入有丝分裂期,从而发挥其抑制HaCat细胞增殖的作用；在通路被阻断后,复方使HaCat细胞G0/G1期所占比重增加,S期下降。
清热活血解毒复方可上调bax的表达,并且该上调作用与复方剂量呈现依赖性；在通路被阻断后,复方对bax的上调能力受到影响,这种影响在高剂量组中表现的尤为突出。清热活血解毒复方可降低TNF-α舌化的HaCat细胞中bcl-xl的表达；在通路被阻断后,复方的下调作用较之阻断前有所加强。
清热活血解毒复方可降低TNF-α活化的HaCat细胞中c-fos的表达,而且下调作用与复方剂量相关：在通路被阻断后,复方对于c-fos蛋白的表达在阻滞前后无明显变化。清热活血解毒复方能够抑制HaCat细胞中IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的分泌。PI3K/Akt信号通路在这些炎症因子的分泌中均起到调节作用,同时在复方抑制HaCat细胞分泌IFN-γ、IL-1β及IL-6的作用存在密切的联系,而在IL-8的分泌上则未表现出明显的相关性。
参考文献
[1]Interleukin‐15 inhibits the expression of differentiation markers induced by Ca2+in keratinocytes[J].Xin Luo,Rui Jin,Fang Wang,Bo Jia,Kang Luan,Feng‐Wei Cheng,Lei Li,Liang‐Dan Sun,Sen Yang,Sheng‐Quan Zhang,Xue‐Jun Zhang.Experimental Dermatology.2016(7)
[2]Astilbin inhibits Th17 cell differentiation and ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like skin lesions in BALB/c mice via Jak3/Stat3 signaling pathway[J].Ting-Ting Di,Zhi-Tong Ruan,Jing-Xia Zhao,Yan Wang,Xin Liu,Ying Wang,Ping Li.International Immunopharmacology.2015
[3]PKA-CREB Signaling Suppresses Tau Transcription[J].Huanliang Liu,Xiaoxia Jin,Xiaomin Yin,Nana Jin,Fei Liu,Wei Qian.Journal of Alzheimer’s Disease.2015(1)
[4]Shikonin suppresses IL-17-induced VEGF expression via blockage of JAK2/STAT3 pathway[J].Yuanyuan Xu,Xuegang Xu,Xinghua Gao,Hongduo Chen,Long Geng.International Immunopharmacology.2014
[5]宋攀.清热活血解毒法调控HaCat细胞PI3K/Akt信号通路的机制研究[D].中国中医科学院,2016.