背景[1-3]
人虹膜色素上皮细胞提取于人虹膜组织，于原代冻存。每管含有细胞数>5×105cells/ml，此细胞通过Cytokeratin-18,Vimentin和Fibronectin免疫荧光染色验证，经测试不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。培养至第二代时，细胞可以达到大约10倍增。
虹膜是一个孔径可变，有颜色的圆盘状物，形成眼睛的瞳孔。鳞片状的上皮细胞覆盖其前表面，双层有颜色的上皮细胞覆盖其后表面。虹膜色素上皮细胞与视网膜色素上皮细胞具有相同的功能特性，比如噬菌作用，降解杆体外节和合成营养因子。近年来，虹膜色素上皮细胞已被移植到视网膜下间隙来治疗视网膜色素上皮细胞缺乏。移植后的巩膜色素上皮细胞可存活数月。移植后的IPE将与固有的RPE在视网膜下腔逐渐发生重塑。细胞的反应是巨噬细胞浸润，这与视网膜色素上皮细胞移植后表现相似。体外研究还表明，虹膜色素上皮细胞表达CD86，通过直接与细胞毒性T4淋巴细胞相关抗原相结合来抑制T细胞活性。
人虹膜色素上皮细胞
细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
应用[4][5]
用于PEDF基因修饰色素上皮细胞对脉络膜新生血管作用的体外研究
分离、培养和纯化原代视网膜（RPE）和虹膜色素上皮细胞（IPE）,比较RPE与IPE的生物学特性。分离和培养原代脉络膜毛细血管内皮细胞（CEC）,建立脉络膜新生血管体外模型。通过体外实验的方法研究色素上皮源性因子（PEDF）及PEDF基因修饰的色素上皮细胞对脉络膜新生血管的作用。
方法:采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE细胞,进行体外培养,密度梯度离心法纯化,免疫组化的方法进行鉴定。观察比较RPE、IPE细胞的超微结构、生长状况,RT-PCR方法检测与RPE功能密切相关的几种蛋白质mRNA的表达。
采用磁分选技术分离培养原代的脉络膜毛细血管内皮细胞,用Ⅳ型胶原铺板,诱导细胞分化、连接形成血管样结构。用脂质体介导基因转染法将人PEDF基因导入体外培养的虹膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞,利用质粒包含的抗稻瘟菌素的耐药性基因筛选稳定表达PEDF的色素上皮细胞株。RT-PCR鉴定PEDF在细胞内的表达;ELISA方法检测细胞分泌PEDF的水平。
采用CulLure Insert共培养PEDF基因修饰的色素上皮细胞和CEC细胞,观察PEDF对有或无血管内皮生长因子（VEGF）刺激条件下CEC的增生、移行和血管样结构的形成的影响效应;ELISA方法检测共培养细胞上清液中VEGF浓度。结
果:纯化后体外培养牛RPE细胞和IPE细胞的角蛋白表达强阳性。原代培养的牛RPE、IPE细胞外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量的色素颗粒、内质网,RPE细胞还含有许多与其吞噬功能相适应的溶酶体。RT-PCR显示RPE和IPE细胞均有视黄醛结合蛋白（CRALBP）、维生素A结合蛋白（RBP）、11-顺视黄醛脱氢酶（11-cis RDH）和组织蛋白酶D（CathepsinD）的mRNA表达。
采用CD31抗体包被的磁珠分离培养的细胞在特殊培养基下生长良好,V-W因子表达阳性,证实为毛细血管内皮细胞。在Ⅳ型胶原的诱导下,细胞生长逐渐形成血管样结构。浓度100ng/mL～1000ng/mL PEDF对20ng/mL的VEGF刺激下CEC细胞的增生、移行有抑制作用（P<0.05）,加入PEDF抗体后,能够阻断其抑制作用。
参考文献
[1]Retinal transplants restore visual responses:trans‐synaptic tracing from visually responsive sites labels transplant neurons[J].Magdalene J.Seiler,Biju B.Thomas,ZhenhaiChen,RongjuanWu,Srinivas R.Sadda,Robert B.Aramant.European Journal of Neuroscience.2008(1)
[2]Neural Regeneration and Cell Replacement:A View from the Eye[J].Deepak Lamba,Mike Karl,Thomas Reh.Cell Stem Cell.2008(6)
[3]Characterization of Müller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration[J].Ryan Thummel,Sean C.Kassen,Jennifer M.Enright,Craig M.Nelson,Jacob E.Montgomery,David R.Hyde.Experimental Eye Research.2008(5)
[4]Pharmacological disruption of the outer limiting membrane leads to increased retinal integration of transplanted photoreceptor precursors[J].E.L.West,R.A.Pearson,M.Tschernutter,J.C.Sowden,R.E.MacLaren,R.R.Ali.Experimental Eye Research.2008(4)
[5]汪枫桦.PEDF基因修饰色素上皮细胞对脉络膜新生血管作用的体外研究[D].复旦大学,2005.