背景[1-3]
NEURO-2A]小鼠脑神经瘤细胞该细胞由RJKlebe和FHRuddle建立，来源于AlbinoA系细胞，小鼠的自发瘤；可产生大量的微管蛋白，该蛋白在对神经细胞的轴浆流动起反应的收缩系统中发挥重要作用。OIE组织用该细胞做狂犬病的常规诊断；鼠痘病毒阴性。
NEURO-2A]小鼠脑神经瘤细胞
细胞培养方法：
1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。
应用[4][5]
用于姜黄素对氧化损伤的小鼠脑神经瘤细胞的保护作用研究
活性氧诱导的氧化应激已被证实与神经退行性疾病的发病机理密切相关。姜黄素是一种从姜科植物中提取的天然多酚类抗氧化物质
利用H2O2诱导氧化损伤的小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2A模型探讨姜黄素的神经保护作用及其机理。将Neuro-2A细胞接种到细胞培养板中,37℃培养过夜,不同浓度姜黄素预孵育1 h,继而30μmol/L H2O2作用24 h。细胞存活率的测定采用MTT法,结果显示25μg/ml姜黄素预孵育1 h可使30μmol/L H2O2处理24 h后的细胞存活率提高8.5%;细胞凋亡的检测使用核染色法,结果显示姜黄素可显著抑制H2O2诱导的Neuro-2A细胞凋亡,姜黄素预孵育1 h可使细胞凋亡率下降15.1%;细胞内总抗氧化能力的测定采用比色法,结果显示25μg/ml姜黄素能够使细胞内总抗氧化能力提高15.9%。应用流式细胞术研究细胞内ROS堆积、线粒体跨膜电位崩塌以及胞外钙离子内流情况,结果显示姜黄素能够抑制细胞内ROS过量生成和胞外钙离子内流,同时可使罗丹明123阴性细胞数比例降低11.81%,即有助于维持正常的线粒体跨膜电位;抗凋亡蛋白表达水平的检测采用Western blot法,结果显示预孵育25μg/ml姜黄素1 h可提高抗凋亡蛋白PARP和Bcl-2的表达量,与H2O2处理组相比,这两种蛋白在细胞内的含量分别提高了12.1%和12.0%;Western blot法与胞浆/胞核蛋白分离法结合用来检测细胞内与凋亡及炎症反应相关的NF-κB信号通路的激活情况,发现姜黄素能够抑制H2O2引起的IκBα降解,进而阻止NF-κB激活,因此抑制其下游目的基因COX-2的表达,与H2O2处理组相比,25μg/ml姜黄素预孵育1 h可使细胞内IκBα含量提高34.3%,抑制NF-κB活化及进入细胞核,进而使得炎症因子COX-2表达量降低31.0%。总而言之,本研究发现姜黄素对H2O2诱导氧化损伤的Neuro-2A细胞具有显著的保护效应。具体的作用机理包括增强细胞内源性总抗氧化能力、抑制ROS堆积、维持正常的线粒体跨膜电位和胞内外钙离子稳态、提高抗凋亡蛋白的表达量,以及阻止NF-κB信号通路的激活。
参考文献
[1]Protective effects of methyl gallate on H 2 O 2-induced apoptosis in PC12 cells[J].James A.G.Crispo,Matthew Piché,Dominique R.Ansell,Joseph K.Eibl,Isabella T.Tai,Aseem Kumar,Gregory M.Ross,T.C.Tai.Biochemical and Biophysical Research Communications.2010(4)
[2]Curcumin-Induced Apoptosis in PC3 Prostate Carcinoma Cells Is Caspase-Independent and Involves Cellular Ceramide Accumulation and Damage to Mitochondria[J].Ashley L.Hilchie,Suzanne J.Furlong,Kimberly Sutton,Angela Richardson,Matthew R.J.Robichaud,Carman A.Giacomantonio,Neale D.Ridgway,David W.Hoskin.Nutrition and Cancer.2010(3)
[3]Anti‐inflammatory and antioxidant properties of Helichrysum italicum[J].Journal of Pharmacy and Pharmacology.2010(3)
[4]Curcumin attenuates 6-hydroxydopamine-induced cytotoxicity by anti-oxidation and nuclear factor-kappaB modulation in MES23.5 cells[J].Jun Wang,Xi-Xun Du,Hong Jiang,Jun-Xia Xie.Biochemical Pharmacology.2009(2)
[5]赵新灿.姜黄素对氧化损伤的小鼠脑神经瘤细胞的保护作用研究[D].江南大学,2011.