背景[1-3]
人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的一株白细胞介素-2依赖型NK细胞株。这株细胞对很多恶性细胞有细胞毒性；铬释放试验显示它能杀死K562和Daudi细胞。
NK-92细胞(经过照射以防止增殖)可以有效地用于血液中白血病的体外免疫清扫而不危及血细胞的功能。NK-92细胞有以下特征：CD2,CD7,CD11a,CD28,CD45,CD54表面标记阳性，CD56亮；CD1,CD3,CD4,CD5,CD8,CD10,CD14,CD16,CD19,CD20,CD23,CD34和HLA-DR表面标记阴性。
人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞
细胞培养步骤
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）MEMα(+0.2mM Inositol（肌醇）+0.1mMβ-mercaptoethanol（β巯基乙醇）β+0.02mM Folic Acid（叶酸）+100-200U/mL recombinant IL-2白介素+12.5%HS(HYCLONE马血清）+12.5%FBS+1%P/S
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
应用[4][5]
用于红桂木凝集素对B淋巴细胞、NK细胞生长的影响及其机制研究
以小鼠脾脏来源B细胞、NK92MI细胞为研究对象,观察ALL对其生长的影响,并初步探索其机制,以期对ALL的免疫调控作用有新的认识,为其在临床疾病防治等方面的开发应用奠定良好的理论和实验基础。
方法:一、ALL对B细胞、NK92MI细胞增殖的影响1、ALL对B细胞增殖的影响无菌条件下取小鼠脾脏,采用Easy SepTM Mouse B cell isolation kit分离纯化B淋巴细胞,将不同浓度红桂木凝集素溶液分别作用B细胞72 h后,倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8法检测B细胞的增殖抑制率。
2、ALL对NK92MI细胞增殖的影响常规培养人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞NK92MI细胞,NK92MI细胞经不同浓度红桂木凝集素溶液分别作用48 h后,倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8法检测NK92MI细胞的增殖抑制率;FACS检测细胞内功能蛋白granzymeA、granzymeB、granulysin、perforin的表达。
二、ALL受体的初步分析FACS分析ALL与NK92MI细胞的结合;FACS分析半乳糖抑制ALL与NK92MI细胞的结合;FITC-ALL与PE-CD45双染的FACS分析;ALL受体与CD45的共定位分析;ALL内吞的观察。
三、ALL诱导NK92MI细胞凋亡的机制研究常规培养人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞NK92MI细胞,NK92MI细胞经不同浓度红桂木凝集素溶液分别作用24h,Annexin-V/PI双染检测NK92MI细胞凋亡;透射电子显微镜观察凋亡小体;PI染色法分析细胞亚二倍体。FACS分析半乳糖对ALL诱导凋亡的抑制作用。荧光定量PCR分析凋亡相关基因的差异表达。FACS检测Caspase-3、Cytochrome-c的表达,Caspase 3抑制剂Z-DEVD-FMK对ALL诱导凋亡的抑制作用。
结果:ALL对B细胞、NK92MI细胞增殖的影响1、ALL抑制B细胞的增殖不同浓度的红桂木凝集素作用B细胞72 h后,对照组细胞生长密集,状态良好,随着红桂木凝集素浓度的增加,细胞数量明显逐渐减少,高倍镜下可见细胞透光度降低,细胞皱缩、边缘不整齐,CCK-8法检测结果表明细胞的增殖受到显著抑制,呈浓度依赖性,与空白组相比均差异显著。
2、ALL抑制NK92MI细胞的增殖不同浓度的红桂木凝集素作用NK92MI细胞48 h后,对照组细胞成团生长,状态良好,随着红桂木凝集素浓度的增加,细胞团逐渐变小,高倍镜下可见细胞透光度降低,细胞皱缩、边缘不整齐,CCK-8法检测结果表明细胞的增殖受到显著抑制,呈浓度依赖性,与空白组相比均差异显著。120μg/ml ALL作用NK92MI细胞24 h后,流式细胞仪检测细胞内Granzyme A、GranzymeB、Granulysin、Perforin的表达,与对照组相比,实验组GranzymeA、Granulysin表达偏高,Perforin表达偏低,Granzyme B表达量相差无异。
参考文献
[1]Effect of carbamate pesticides on perforin,granzymes A-B-3/K,and granulysin in human natural killer cells[J].Qing Li,Maiko Kobayashi,Tomoyuki Kawada.International Journal of Immunopathology and Phar.2015(3)
[2]Plant lectins,from ancient sugar‐binding proteins to emerging anti‐cancer drugs in apoptosis and autophagy[J].Q.‐L.Jiang,S.Zhang,M.Tian,S.‐Y.Zhang,T.Xie,D.‐Y.Chen,Y.‐J.Chen,J.He,J.Liu,L.Ouyang,X.Jiang.Cell Prolif..2015(1)
[3]Role of PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK pathway in Concanavalin A induced autophagy in HeLa cells[J].Bibhas Roy,Arup K.Pattanaik,Joyjyoti Das,Sujit K.Bhutia,Birendra Behera,Prashant Singh,Tapas K.Maiti.Chemico-Biological Interactions.2014
[4]Antitumor effect of soybean lectin mediated through reactive oxygen species-dependent pathway[J].Prashanta Kumar Panda,Subhadip Mukhopadhyay,Birendra Behera,Chandra Sekhar Bhol,Sandeep Dey,Durgesh Nandini Das,Niharika Sinha,Akalabya Bissoyi,Krishna Pramanik,Tapas K.Maiti,Sujit K.Bhutia.Life Sciences.2014(1-2)
[5]尹利君.红桂木凝集素对B淋巴细胞、NK细胞生长的影响及其机制研究[D].广西医科大学,2016.