背景[1-3]
人Α乳清蛋白(Α-LA)ELISA KIT用于测定血清，血浆及相关液体等样本中Α乳清蛋白(Α-LA)的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人α乳清蛋白（α-La）水平。用纯化的人α乳清蛋白（α-La）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入α乳清蛋白（α-La），再与HRP标记的α乳清蛋白（α-La）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的α乳清蛋白（α-La）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人α乳清蛋白（α-La）浓度。
人Α乳清蛋白(Α-LA)ELISA KIT
操作步骤：
1、取出试剂盒,室温(20-25℃)放置30分钟。
2、分组:取出96孔板,根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔,1个空白对照
3、标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100ul,然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100ul,弃掉。第六只试管作为0号标准品。
4、加样:依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中;空白对照孔加入50ul的蒸馏水;其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
5、温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
6、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒弃去,如此重复5次,拍干。
7、加酶标溶液:标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液(空白对照孔除外)。
8、温育:酶标板用封板纸密封后,放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。
9、洗板:用稀释后的洗涤液注满每孔,静置15-30s,充分清洗酶标板5次,用吸水纸彻底拍干。
10、显色:各孔加入显色剂A液50ul后,再加入显色剂B液50ul。
11、终止:25-37℃下避光反应10-15分钟,加入50ul终止液。
12、读板:在450nm波长读取各孔的OD值。
应用[4][5]
用于金黄色葡萄球菌影响乳蛋白合成的机制及绿原酸的保护作用研究
金黄色葡萄球菌可以入侵奶牛乳腺上皮细胞（Bovine Mammary Epithelial Cells,BMECs）,影响BMECs炎症因子的表达以及乳蛋白的合成。绿原酸（Chlorogenic Acid,CGA）是一种广泛存在于多种植物中的天然产物,具有抗氧化、抗炎等多种生物学活性,在奶牛乳腺炎防治中得到应用。
本实验的主要研究内容如下:（1）制备BMECs体外乳腺炎模型,通过胞内菌平板菌落计数、透射电镜观察和激光共聚焦显微镜观察确定金黄色葡萄球菌可以入侵BMECs;
（2）通过ELISA、RT-q PCR、Western blot检测金黄色葡萄球菌侵染后对促炎因子表达（TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8）、氨基酸吸收（蛋氨酸Met和赖氨酸Lys）以及α-乳清蛋白（α-Lactalbumin,α-LA）,β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin,β-LG）和β-酪蛋白（β-Casein,CSN2）)合成的影响;
（3）在金黄色葡萄球菌入侵细胞的同时外源添加CGA,通过ELISA和RT-q PCR检测外源添加CGA后炎症因子以及乳蛋白的表达量的变化,探究CGA对金黄色葡萄球菌侵染BMECs的保护作用;
（4）提取细胞总RNA进行转录组测序,通过比较转录组学分析发现差异表达基因并予以验证,对CGA作用的潜在靶标进行预测;
（5）根据转录组分析结果,通过ELISA、RT-q PCR、Western blot等实验方法对CGA在缓解金黄色葡萄球菌侵染BMECs导致的乳蛋白合成减少中的作用与机制进行探讨。
实验结果表明:（1）金黄色葡萄球菌可以入侵BMECs,并且随着入侵时间的增加,细胞内的细菌数目增多;
（2）金黄色葡萄球菌入侵可以促进炎症因子的表达（p<0.05）,抑制BMECs对外源Met和Lys的吸收（p<0.05）、抑制乳蛋白的合成和分泌（p<0.05）;
（3）金黄色葡萄球菌入侵BMECs时外源添加CGA的处理浓度为40μg/m L,处理时间为48 h,该处理条件的CGA对金黄色葡萄球菌和BMECs的增殖均无显著影响,并且能够缓解金黄色葡萄球菌入侵BMECs引起的炎症因子升高;
（4）侵染时CGA处理能够减少BMECs中金黄色葡萄球菌的数量（p<0.01）;
（5）CGA处理能够缓解金黄色葡萄球菌侵染BMECs引起的对Met和Lys吸收以及乳蛋白合成的减少（p<0.05）;
（6）转录组测序结果显示CGA处理组vs.Control组、金黄色葡萄球菌侵染组vs.Control组、CGA预处理+金黄色葡萄球菌侵染组vs.金黄色葡萄球菌侵染组3个差异分组中检测到的差异表达基因数量分别为94个、111个和77个;
（7）CGA能够促进BMECs中IL-10和IL-10RA的表达,从而缓解金黄色葡萄球菌侵染BMECs引起的乳蛋白合成减少（p<0.05）和NF-κB的激活作用;
（8）CGA能够缓解金黄色葡萄球菌侵染BMECs导致的对m TOR、S6、STAT5磷酸化的抑制作用;
（9）金黄色葡萄球菌侵染BMECs抑制转录因子类固醇生成因子1（Steroidogenic Factor 1,SF-1）的表达,SF-1基因沉默,乳蛋白的合成受抑,而CGA能够缓解SF-1沉默导致的α-LA、β-LG和CSN2的合成减少;
（10）CGA抗炎的作用靶可能是NF-κB,促进乳蛋白合成的作用靶可能是SF-1。综上所述,金黄色葡萄球菌能够入侵BMECs并在细胞内增殖,导致BMECs对外源氨基酸吸收减少,进而抑制乳蛋白合成。而CGA预处理金黄色葡萄球菌入侵的BMECs,对于这一现象具有缓解作用。
参考文献
[1]The Role of the Anti-Inflammatory Cytokine Interleukin-10 in Tissue Fibrosis.[J].Steen Emily H,Wang Xinyi,Balaji Swathi,Butte Manish J,Bollyky Paul L,Keswani Sundeep G.Advances in wound care.2020(4)
[2]Cilostazol add-on therapy for celecoxib synergistically inhibits proinflammatory cytokines by activating IL-10 and SOCS3 in the synovial fibroblasts of patients with rheumatoid arthritis.[J].Lee Yi Sle,Lee Sang Yeob,Park So Youn,Lee Sung Won,Hong Ki Whan,Kim Chi Dae.Inflammopharmacology.2019(6)
[3]Transcriptome Sequencing Approaches to Elucidate Host-Microbe Interactions in Opportunistic Human Fungal Pathogens.[J].Hovhannisyan Hrant,Gabaldón Toni.Current topics in microbiology and immunology.2019
[4]Creating a Workplace Culture of Preventive Health:Process and Outcomes of the Colon Cancer-Free Zone at Virginia Cooperative Extension.[J].Rafie Carlin L,Hauser Lindsay,Michos John,Pinsky Jeffrey.Journal of cancer education:the official journal of the American Association for Cancer Education.2019(6)
[5]季嫱.金黄色葡萄球菌影响乳蛋白合成的机制及绿原酸的保护作用[D].内蒙古大学,2021.