背景[1-3]
褪黑素(MT)ELISA KIT用于测定血清、血浆、组织及相关液体样本中褪黑素(MT)的含量或活性。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中褪黑素(MT)水平。用纯化的褪黑素(MT)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入褪黑素(MT)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的褪黑素(MT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中褪黑素(MT)含量。
褪黑素(MT)ELISA KIT
样品收集、处理及保存方法：
1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：edta、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
应用[4][5]
用于褪黑素在绵羊附睾中的合成及其对附睾上皮细胞生理功能的调控研究
以绵羊附睾为研究对象,运用液相质谱联用、实时荧光定量PCR（RT-q PCR）、蛋白免疫印迹（Western blotting）、免疫组织化学、组织和细胞免疫荧光等方法,探究绵羊附睾中褪黑素的合成和受体的表达;褪黑素对绵羊附睾尾中双氢睾酮合成及其合成酶表达的影响;蛋白质组学层面褪黑素对绵羊附睾功能的调控;褪黑素对绵羊附睾尾上皮细胞炎症反应的调控机制。
得到的结果如下:1.褪黑素及其合成酶AANAT、HIOMT、MT1和MT2在绵羊附睾中的合成免疫组织化学和免疫荧光结果显示AANAT、HIOMT、MT1和MT2在附睾头、体和尾上皮细胞和平滑肌细胞中均有分布,且主要分布在附睾上皮细胞中。液相质谱联用测得褪黑素在附睾尾中的含量显著高于附睾头和体。RT-q PCR和Western blotting结果显示,与液相质谱联用结果相似,AANAT、HIOMT、MT1和MT2在附睾尾中的m RNA和蛋白水平最高。同时绵羊精子免疫荧光和Western blotting显示MT1和MT2主要定位于精子颈部和尾部,表达量随着精子的成熟程度增加而增加。
2. 褪黑素对绵羊附睾尾上皮细胞中DHT合成的影响通过酶消化法体外培养绵羊附睾尾上皮细胞,并用不同浓度的褪黑素及luzindole（N-acetyl-2-benzyltryptamine）（MT1和MT2非选择性拮抗剂）和4P-PDOT（4-phenyl-2-propionamidotetralin）（MT2选择性拮抗剂）处理附睾尾上皮细胞。通过ELISA、q PCR和western blotting实验发现,10-9、10-8和10-7M褪黑素显著抑制了附睾尾上皮细胞中DHT合成,并且10-10-10-7M褪黑素显著抑制了DHT合成酶5α-red1和5α-red2 m RNA和蛋白表达。另外,细胞免疫荧光检测发现MT1和MT2表达于附睾尾上皮细胞中。褪黑素和4P-PDOT或luzindole共同处理阻断了附睾尾上皮细胞中褪黑素对DHT合成和5α-red1和5α-red2表达的抑制作用,并且luzindole的阻断作用更加显著。
3. 附睾头上皮细胞iTRAQ蛋白质组学分析本实验通过蛋白质组学iTRAQ技术分析鉴定10-7 M褪黑素处理后,绵羊附睾头上皮细胞中的差异表达蛋白。经过生物学技术分析共发现69个差异表达蛋白,其中褪黑素处理后的附睾头上皮细胞中41个上调蛋白,28个下调蛋白。另外通过q PCR和western blotting技术验证了6个差异表达蛋白SOD、COL1A1、COL1A2、PRM1、NQO2和FN1的表达。结果显示这些蛋白的表达趋势和iTRAQ分析结果相符,这说明iTRAQ分析结果是可靠的。同时通过生物信息学分析发现褪黑素可通过调节抗氧化和抗炎反应等过程中的相关蛋白水平从而参与对附睾上皮细胞功能的调节。
4.褪黑素对绵羊附睾尾上皮细胞炎性反应的影响通过酶消化法体外培养绵羊附睾尾上皮细胞,使用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）建立体外炎症模型。利用q PCR和western blotting技术检测褪黑素对LPS诱导的绵羊附睾尾上皮细胞炎症反应的调控作用。
参考文献
[1]Melatonin alleviates LPS-induced endoplasmic reticulum stress and inflammation in spermatogonial stem cells.[J].Journal of cellular physiology.2020
[2]The Role of the Epididymis and the Contribution of Epididymosomes to Mammalian Reproduction[J].Emma R.James,Douglas T.Carrell,Kenneth I.Aston,Timothy G.Jenkins,Marc Yeste,Albert Salas-Huetos.International Journal of Molecular Sciences.2020(15)
[3]Improved viability and fertility of frozen-thawed dog sperm using adipose-derived mesenchymal stem cells.[J].Qamar Ahmad Yar,Fang Xun,Kim Min Jung,Cho JongKi.Scientific reports.2020(1)
[4]The Exacerbation of Aging and Oxidative Stress in the Epididymis of Sod1 Null Mice[J].Anaīs Noblanc,Alicia Klaassen,Bernard Robaire.Antioxidants.2020(2)
[5]葛闻博.褪黑素在绵羊附睾中的合成及其对附睾上皮细胞生理功能的调控研究[D].甘肃农业大学,2021.