背景[1-3]
小鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA试剂盒用于定量或定性检测血清、血浆、组织液的液体样本中的基质金属蛋白酶13(MMP-13)。
试剂盒检测原理：本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被小鼠基质金属蛋白酶13多克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中小鼠基质金属蛋白酶13浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中小鼠基质金属蛋白酶13含量。
小鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA试剂盒
检测程序
1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。
4.洗板：同前。
5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。
6.洗板：同前。
7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。
8.每孔加入100ul终止液混匀。
9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。
结果计算与判断
1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.以标准品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应MMP-13含量即可。
应用[4][5]
用于经LV-mmp13转染的巨噬细胞逆转日本血吸虫病肝纤维化的研究
研究表明,Ⅱ型弓形虫的致密颗粒蛋白15（dense granule protein15Ⅱ,GRA15Ⅱ）可诱导巨噬细胞向M1极化;构建的gra15Ⅱ慢病毒（lentivirus-gra15Ⅱ,LV-gra15Ⅱ）能转化巨噬细胞为M1（LV-gra15Ⅱ-M1）而使后者发挥有效的预防日本血吸虫病肝纤维化的作用。其中,LV-gra15Ⅱ-M1分泌的基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13,MMP-13）在溶解胶原纤维中起到重要的作用。
构建mmp13慢病毒,并体外转染巨噬细胞。将该巨噬细胞（LV-mmp13-M）输注入日本血吸虫病小鼠体内,了解其对日本血吸虫病肝纤维化的治疗作用和机制。方法首先构建LV-mmp13和LV-gra15Ⅱ,然后将其转入巨噬细胞株RAW264.7中,并筛选出稳定的LV-gra15Ⅱ-M、LV-mmp13-M。用流式测定Ly6C以了解Ly6C表达情况。血吸虫尾蚴感染雌性Balb/c小鼠6周后,将小鼠随机分为四组:PBS、LV-blank-M、LV-gra15Ⅱ-M和LV-mmp13-M组,并分别通过尾静脉高压注射相应的细胞和PBS。在感染后第8周无痛麻醉处死所有小鼠。取血清检测谷丙转氨酶（glutamic-pyruvictransaminase,ALT）、用ELISA检测HA含量,取肝脏组织分别做羟脯胺酸（HYP）含量检测、H&E和Masson染色,并用qRT-PCR、Western-blotting及免疫组化测定MMP13、iNOS、Arg-1、CCL2、α-SMA、ColⅠ。
在体外实验中,分别将RAW264.7、LV-blank-M、LV-gra15Ⅱ-M和LV-mmp13-M与小鼠成纤维细胞株JS1共培养,ELISA方法检测培养液中ColⅠ、MMP13和CCL2含量,流式检测JS1凋亡。
结果成功构建了稳定表达的LV-mmp13-M和LV-gra15Ⅱ-M,其中,LV-gra15Ⅱ-M具有M1表型。LV-mmp13-M表现为Ly6C低表达而LV-gra15Ⅱ-M为高表达。在LV-mmp13-M组中,血HA、肝HYP、ColⅠ、肝虫卵肉芽肿和纤维化程度均明显改善,说明LV-mmp13-M能有效逆转肝纤维化。进一步的研究表明,LV-mmp13-M顺利进入肝组织中,并分泌大量的MMP13蛋白,后者促进了胶原蛋白溶解。
此外,LV-mmp13-M分泌的CCL2及其他细胞因子在诱导肝成纤维细胞的凋亡,抑制肝纤维化方面也起到了一定的作用。本研究也表明,LV-gra15Ⅱ-M没有明显的治疗肝纤维化的作用。结论LV-mmp-13-M通过分泌MMP13、CCL2及其他细胞因子溶解胶原纤维并促使肝成纤维细胞的凋亡而发挥逆转日本血吸虫病肝纤维化的作用。
参考文献
[1]Matrix metalloproteinases and liver fibrosis（translational aspects）[J].Elke Roeb.Matrix Biology.2018
[2]Physician-patient Interactions in African American Patients with Systemic Lupus Erythematosus:Demographic Characteristics and Relationship with Disease Activity and Depression[J].Cristina Drenkard,Gaobin Bao G,TenéT Lewis,Bonnie Pobiner,Julie Priest J,S.Sam Lim.Seminars in Arthritis and Rheumatism.2018
[3]The Changing Face of Hepatocellular Carcinoma:Forecasting Prevalence of Nonalcoholic Steatohepatitis and Hepatitis C Cirrhosis[J].Osmanuddin Ahmed,Lisa Liu,Antony Gayed,Amanjit Baadh,Mikin Patel,Jordan Tasse,Ulku Turba,Bulent Arslan.Journal of Clinical and Experimental Hepatology.2018
[4]Cytotherapy with M1-polarized macrophages ameliorates liver fibrosis by modulating immune microenvironment in mice[J].Peng-Fei Ma,Chun-Chen Gao,Jing Yi,Jun-Long Zhao,Shi-Qian Liang,Yang Zhao,Yu-Chen Ye,Jian Bai,Qi-Jun Zheng,Ke-Feng Dou,Hua Han,Hong-Yan Qin.Journal of Hepatology.2017
[5]金猛猛.经LV-mmp13转染的巨噬细胞逆转日本血吸虫病肝纤维化的研究[D].安徽医科大学,2019.