背景[1-3]
人组蛋白H2B(HISTON-H2B)ELISA试剂盒用于检测血清、组织等多种样本中组蛋白H2B(HISTON-H2B)的含量。
检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被样本抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的样本呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人组蛋白H2B(HISTON-H2B)ELISA试剂盒
样品收集、处理及保存方法
1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
应用[4][5]
用于精子发生过程中组蛋白H2A.H2B编码及功能研究
哺乳动物精子发生过程（Spermatogenesis process）是一被精确调控的复杂的细胞分化过程。原始生殖细胞经有丝分裂,两次减数分裂和变态过程最终发育成成熟精子。该过程中最显著的一个特点就是染色体重建（Chromatin remolding）,其机制主要从两个方面来解读,,精子发生过程中有大量不同种类的组蛋白合成;第二,这些组蛋白的翻译后修饰可能呈现时间及空间特异性。“生精细胞特异的组蛋白编码”这一概念也随之提出,而目前还没有这方面系统的研究。为了更好地理解精子发生过程中染色体重建。
方法:首先应用密度梯度沉降的方法分离精原细胞,精母细胞和圆形精子细胞;分别纯化各细胞的组蛋白,应用HPLC进一步分离纯化组蛋白各组分（H1,H2A,H2B,H3,H4）。纯化后的组蛋白H2A和H2B经蛋白酶酶切,应用LC-MS;LC-MS/MS分析H2A.H2B的亚型种类及其翻译后修饰。联合应用Pull-down和免疫共沉淀的方法来鉴定识别组蛋白修饰基团的伴侣分子。
研究结果:精子发生过程中,一共鉴定了7种H2A亚型,睾丸组织特异的组蛋白TH2A首先出现在精原细胞中。发现了一些新的位于H2A1 C末端的翻译后修饰,包括K99和K100的甲基化,K119的二甲基化和K96的乙酰化。同时鉴定了6种H2B亚型。
在此期间,睾丸组织特异的组蛋白TH2B的翻译后修饰呈动态变化:精原细胞中乙酰化TH2B的相对丰度最高,约有28.9%的TH2B为乙酰化状态;精母细胞乙酰化的TH2B降到了最低（8.3%）,到了圆形精子细胞阶段乙酰化的TH2B约为11.2%。同时也鉴定了几种TH2B的翻译后修饰,TH2B的N端呈高乙酰化修饰状态;在TH2B的C端,我们发现了T116的磷酸化和K117的甲基化（乙酰化）,形成了两个新的“磷酸化开关”（phospho switch）。
蛋白-蛋白相互作用的结果提示,蛋白质TRRAP,CENP-E和PTP-BL可能是识别H2B PhT116/AcK117的蛋白因子,提示该组合修饰可能参与了减数分裂过程中的染色体分离。另外,应用质谱技术描述了参与精子发生的组蛋白H1的多样性。
结论:本研主要应用质谱技术描述了精子发生过程中组蛋白H2A和H2B的亚型种类及其翻译后修饰;鉴定了识别其特异修饰基团的蛋白质。该研究尽管还不尽完善,为进一步理解精子发生过程中染色体的重建奠定了基础。
参考文献
[1]Ectopic expression of Histone H2AX mutants reveal a role for its post-translational modifications[J].Jonathan Rios-Doria,Aneliya Velkova,Virna Dapic,Jose?M.Gala?n-Caridad,Vesna Dapic,Marcelo A.Carvalho,Johana Melendez,Alvaro N.A.Monteiro.Cancer Biology&Therapy.2009(5)
[2]A PP4-Phosphatase Complex Dephosphorylatesγ-H2AX Generated during DNA Replication[J].Dipanjan Chowdhury,Xingzhi Xu,Xueyan Zhong,Fariyal Ahmed,Jianing Zhong,Ji Liao,Derek M.Dykxhoorn,David M.Weinstock,Gerd P.Pfeifer,Judy Lieberman.Molecular Cell.2008(1)
[3]Role of homologous recombination in trabectedin-induced DNA damage[J].M.Tavecchio,M.Simone,E.Erba,I.Chiolo,G.Liberi,M.Foiani,M.D’Incalci,G.Damia.European Journal of Cancer.2008(4)
[4]Tissue-specific DNA-PK-dependent H2AX phosphorylation andγ-H2AX elimination after X-irradiation in vivo[J].Manabu Koike,Jun Sugasawa,Mariko Yasuda,Aki Koike.Biochemical and Biophysical Research Communications.2008(1)
[5]鲁爽.精子发生过程中组蛋白H2A.H2B编码及功能研究[D].中国协和医科大学,2009.