背景[1-3]
大鼠脂肪间充质干细胞取自SD大鼠的腹股沟脂肪，这些细胞能够表达ADSCs的特定蛋白，贴壁培养后使用带有GFP基因的慢病毒转导，使细胞稳定表达GFP。拥有强大的增殖和多向分化能力，可作为细胞模型应用于增殖、衰老、免疫、分化和移植研究。
脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶；贮存的脂肪，在需要时可迅速分解成甘油和脂肪酸，经血液输送到各组织以供利用。它们影响胰岛素敏感性、血压水平、内皮功能、纤溶活动及炎症反应，参与多种重要病理生理过程；脂肪组织已由过去单纯作为能量储存的器官而成为一个极其重要的内分泌系统。
脂肪组织中也存在一些干细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，被称为脂肪组织来源的间充质干细胞，简称脂肪间充质干细胞。与骨髓间充质干细胞相比，在来源、细胞群特点以及分化潜能等多方面极为相似。但是，脂肪间充质干细胞更易获得足够数量的细胞，且获取过程中对机体损伤更小，是更为理想的自体干细胞源。
大鼠脂肪间充质干细胞
培养步骤：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于番茄红素对氧化应激下小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化的保护作用研究
从小鼠腹股沟脂肪中成功分离培养出脂肪间充质干细胞（ADSC）;成功完成ADSC的传代、冻存及复苏;对ADSC进行干性鉴定。
方法:1.根据I型胶原酶酶消法从小鼠的腹股沟脂肪分离提取ADSC并进行体外培养;利用胰酶酶消法进行细胞传代;利用梯度冻存法液氮保存的方法进行细胞冻存;分别利用流式细胞技术鉴定ADSC表面标志物,利用分化实验鉴定ADSC的多向分化能力。
2. 利用不同浓度的H2O2对ADSC进行干预,显微镜观察细胞的生长状态,利用CCK-8、TUNEL实验检测不同浓度H2O2对ADSC的增殖活力及凋亡情况的影响,利用ROS染色技术观察不同浓度H2O2对ADSC产生ROS水平的影响。
3. 利用番茄红素干预H2O2诱导的ADSC的氧化应激模型,分别利用CCK-8、TUNEL实验、ROS染色技术检测番茄红素对氧化应激下ADSC的增殖能力的影响,利用ALP染色及活性检测实验、茜素红染色及钙定量检测实验、PCR及Western blot实验检测番茄红素对氧化应激下ADSC的成骨能力的影响。
结果:1.所培养的ADSC中间充质干细胞阳性表面标志物CD29、CD90表达率均在90%以上,阴性表面标志物CD45表达率在5%以下;诱导成脂分化行油红O染色可见橘红色脂滴;诱导成骨分化行茜素红染色可见砖红色钙结节沉积。
2. CCK-8、TUNEL实验、ROS染色技术检测发现H2O2可以诱导小鼠ADSC产生ROS,并发生氧化应激反应,少量的ROS可以促进小鼠ADSC的细胞增殖,过量的ROS会抑制小鼠ADSC的细胞增殖,同时会诱导细胞凋亡。
3.CCK-8、TUNEL实验、ROS染色技术检测发现各组ADSC的增殖率高低次序为空白对照组=番茄红素组>共处理组>氧化应激组,凋亡率及ROS水平高低次序为氧化应激组>共处理组>空白对照组>番茄红素组;通过ALP染色及活性检测实验、茜素红染色及钙定量检测实验发现各组ADSC的ALP活性大小为空白对照组=番茄红素组>共处理组>氧化应激组,各组ADSC的钙含量大小为番茄红素组>空白对照组>共处理组>氧化应激组;通过PCR及Western blot实验检测各组ADSC的COL1、OCN及RUNX2的基因及蛋白表达情况发现番茄红素组的成骨相关的重要基因和蛋白表达水平较空白对照组明显升高,氧化应激组的基因和蛋白表达水平较空白对照组明显下降,共处理组因番茄红素的干预,各项基因和蛋白表达水平较氧化应激组明显改善。
参考文献
[1]Activation of ALDH1A1 by omeprazole reduces cell oxidative stress damage[J].Luis Francisco Calleja,Belem Yoval-Sánchez,Luz Hernández-Esquivel,Juan Carlos Gallardo-Pérez,Marcela Sosa-Garrocho,álvaro Marín-Hernández,Ricardo Jasso-Chávez,Marina Macías-Silva,JoséSalud Rodríguez-Zavala.The FEBS Journal.2021(13)
[2]Optimization of oxidative stress for mesenchymal stromal/stem cell engraftment,function and longevity[J].Denu Ryan A.,Hematti Peiman.Free Radical Biology and Medicine.2021
[3]Reactive Oxygen Species（ROS）-Responsive Prodrugs,Probes,and Theranostic Prodrugs:Applications in the ROS-Related Diseases.[J].Wang Pengfei,Gong Qijie,Hu Jiabao,Li Xiang,Zhang Xiaojin.Journal of medicinal chemistry.2020
[4]HIF/Ca2+/NO/ROS is critical in roxadustat treating bone fracture by stimulating the proliferation and migration of BMSCs.[J].Chen Chunxia,Yan Shihai,Qiu Shuang,Geng Zhirong,Wang Zhilin.Life sciences.2020
[5]刘宸境.番茄红素对氧化应激下小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化的保护作用[D].青岛大学,2021.