背景[1-3]
AGL1 ELECTRO感受态细胞是以为C58,RecA型背景，核基因中含有筛选标签—利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pTiBo542DT-DNA，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。
AGL1 ELECTRO感受态细胞
操作方法
1.0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入0.01-1μg质粒DNA(体积不大于6ul,感受态转化效率较高,次使用前*做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。
3.启动电转仪,设置参数:C=25μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此参数为Biorad推荐,使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中,加入700μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天
注意事项
1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2.混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。
4.利福平浓度不应高于25μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50μg/ml kan,若所用平板含有20μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失,但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素,Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。
应用[4][5]
用于油菜花叶病毒（ORMV）126kDa复制酶基因在拟南芥中的可诱导表达研究
RNA干扰是由双链RNA分子介导的、序列特异的转录后基因沉默现象。植物体内的小RNA在植物对抗病毒的RNA干扰机制中起着核心作用,它来自于非蛋白编码RNA的前体。小RNA通过碱基互补配对原则与靶mRNA结合起负调控的作用,利用sRNA抗植物病毒是近年来所研究的一种有效手段。但是病毒为了有效侵染植物,就必须抑制植物体内RNAi机制。
因此,植物病毒同时也能够编码蛋白在RNAi的不同步骤起到抑制作用,这类蛋白被称为基因沉默抑制因子。油菜花叶病毒ORMV作为危害油菜等作物生产的病毒之一,属于烟草花叶病毒属。ORMV基因结构中的复制酶基因表达的126kDa蛋白是一种基因沉默抑制因子。
126kDa复制酶蛋白在体外（in vitro）可结合21nt左右的小RNA,油菜花叶病毒的侵染不仅能引起21nt小RNA的积累,还对该类小RNA的底物mRNA的表达产生了影响。为了进一步验证复制酶蛋白在体内（in vivo）对21nt小RNA的结合富集作用,同时为了更好地了解复制酶蛋白对植物内源转录本的影响,以及其如何通过影响小RNA进而影响小RNA底物mRNA的表达,我们尝试在植物中过量表达该蛋白。但是前期的实验没有获得持续过量地表达该蛋白的植物,这可能是因为过量表达该蛋白对植物有害。
利用植物的可诱导表达技术,在拟南芥中有条件地表达126kDa复制酶蛋白,进而研究ORMV 126kDa复制酶蛋白对植物内源小RNA代谢与功能的影响。这些内源小RNA与植物对病毒侵染的应答有着紧密联系,所以研究这些富集的小RNA类别及作用机制也有助于抗病育种的进一步发展。Silwet-L77是一种非离子型的表面活性剂,常用于植物的转化。研究发现,SilwetL77的加入也可以显著地提高大肠杆菌的转化效率。
同时,比较了不同培养温度、不同培养浓度（OD600值）及不同冷冻保护剂对感受态细胞转化效率的影响。发现,28℃培养E.coli至OD600值为0.55-0.6之间时制备感受态细胞,利用9%的DMSO做为冷冻保护剂冷冻保存感受态细胞,转化时加入1520ppm的Silwet-L77,可以获得最高的转化效率。总之,进一步优化了大肠杆菌感受态细胞的制备方法以及转化方法。
参考文献
[1]Non-Protein-Coding RNAs and their Interacting RNA-Binding Proteins in the Plant Cell Nucleus[J].Celine Charon,Ana Beatriz Moreno,Florian Bardou,Martin Crespi.Molecular Plant.2010(4)
[2]The biosynthetic pathways and biological scopes of plant small RNAs[J].Franck Vazquez,Sylvain Legrand,David Windels.Trends in Plant Science.2010(6)
[3]Criteria for Annotation of Plant MicroRNAs[J].Meyers,Blake C,Axtell,Michael J,Bartel,Bonnie,Bartel,David P,Baulcombe,David,Bowman,John L,Cao,Xiaofeng,Carrington,James C,Chen,Xuemei,Green,Pamela J,Griffiths-Jones,Sam,Jacobsen,Steven E,Mallory,Allison C,Martienssen,Robert A,Poethig,R Scott,Qi,Yijun,Vaucheret,Herve,Voinnet,Olivier,Watanabe,Yuichiro,Weigel,Detlef,Zhu,Jian-Kang.Plant Cell.2008(12)
[4]A single copy of a virus‐derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus[J].Ming‐BoWang,David C.Abbott,Peter M.Waterhouse.Molecular Plant Pathology.2008(6)
[5]黄学娟.油菜花叶病毒（ORMV）126kDa复制酶基因在拟南芥中的可诱导表达[D].聊城大学,2017.