背景[1-3]
无脂肪酸牛血清白蛋白BSA是使用热处理方法纯化而来的超纯粉末。经过专门的去脂纯化处理，脂肪酸含量低于0.002%(w/w)，性价比高，方便溶解。该无脂肪酸BSA可用于脂肪代谢相关分析的载体蛋白，也可与某种特异性的脂肪酸结合以形成白蛋白，可应用于增强细胞培养。
牛血清白蛋白（bovine serum albumin,bsa）是牛血清中的一种球蛋白，又称第五组分（需要注意的是，第五组分并不是bsa的一种组份，而是edwin j.cohn教授早期从血液中通过特定的分离技术得到5种组份，其中第五种就是白蛋白），cas号为9048-46-8，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kda，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为封闭试剂。
无脂肪酸牛血清白蛋白
血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、ph缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。
牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)是常用的试剂。在血液中，白蛋白与游离脂肪酸紧密结合在一起，形成最简单的脂蛋白复合物。常规方法纯化的BSA难以有效去除其结合的脂肪酸。除了特别纯化的BSA产品外，普通BSA试剂含脂肪酸量的范围一般是:每mol BSA含0.2~1.5 mol脂肪酸。然而，一些生物医学研究要求使用不含游离脂肪酸的BSA，否则BSA所含高浓度的脂肪酸将影响细胞培养、分化、代谢反应、生化测定等。例如，在3T3-L1脂肪细胞分化过程中不能使用普通BSA试剂，否则影响分化和细胞代谢状态；在测定培养的组织细胞释放的游离脂肪酸浓度时，也必须用不含脂肪酸的BSA，否则难以准确测定甘油三酯水解和游离脂肪酸释放。
应用[4][5]
用于间充质干细胞对动脉粥样硬化斑块的作用及机制研究
探究正常和多柔比星诱导后MSCs分别在高脂和正常生理环境中分泌的外泌体（Exosome,exo）对AS进展的作用,进一步探索其中的机制,为提高MSCs治疗疗效提供潜在的思路。
方法:（1）在体外培养获得正常的MSCs（Con-MSCs）和多柔比星诱导的MSCs（Dox-MSCs）,衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色作为金标准鉴定干细胞的衰老状态,用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）的方法检测衰老相关基因和蛋白表达,以及流式分析鉴定细胞标志蛋白。
（2）Apoe-/-小鼠高脂饮食建立AS模型,隔周注射5×10^5个MSCs,为期3个月,小鼠牺牲后进行主动脉斑块油红染色、苏木素-伊红染色和天狼猩红染色,以及细胞成分染色。对巨噬细胞的M1和M2亚型进行荧光染色,分析M2/M1占比。
（3）通过超速离心的方法提取获得四种不同处理的MSC分泌的exo,依此标记为Con-PA-exo、Con-BSA-exo、Dox-PA-exo和Dox-BSA-exo。其中,棕榈酸（palmitic acid）标记为PA,去脂肪酸牛血清白蛋白（Fatty acid free-Bovine serum albumin）标记为BSA。用电镜、粒径分析以及WB鉴定exos。
（4）在细胞水平上,将上述四种exo与小鼠巨噬细胞共培养,加以脂质刺激,进行油红染色,分析泡沫细胞占比。PCR技术检测巨噬细胞膜上脂质吞噬和转运相关受体表达情况。
（5）外泌体进行miRNAs测序,分析差异性miRNAs,预测靶基因和信号通路。
结果:（1）0.25u M多柔比星诱导48小时后,MSCs的表面标志蛋白未发生改变,但是SA-β-Gal染色阳性率高且不出现明显凋亡,衰老保护基因sirt1表达下调,细胞周期相关基因表达改变。
（2）MSCs能增加斑块内巨噬细胞的数量,Con-MSCs改善巨噬细胞的炎性调控功能和抑制斑块面积,而Dox-MSCs对巨噬细胞的炎性调控功能和斑块的抑制作用下降。
（3）超速离心法提取获得的exo电镜下呈双层囊泡结构,粒径大小富集在30-200nm,标志蛋白Alix、TSG101、CD9和CD63阳性。
（4）Con-MSCs-exo下调巨噬细胞CD36表达,上调ABCA1和ABCG1的表达,而Dox-MSCs-con对巨噬细胞脂质代谢蛋白的表达调控下降。
（5）不同组间外泌体miRNAs测序结果显示不同预处理组之间存在差异性miRNAs,且预测的信号通路富集在细胞代谢上。
结论:相较于Con-MSCs,Dox-MSCs调控巨噬细胞炎性功能的作用下降和延缓斑块进展的作用减弱。而且,短暂的高脂可增强MSCs对巨噬细胞的炎性调控。这都依赖于MSCs的差异miRNAs表达谱。
参考文献
[1]Dynamic transcriptome profiling in DNA damage-induced cellular senescence and transient cell-cycle arrest[J].Zhen Zhao,Qiongye Dong,Xuehui Liu,Lei Wei,Liyang Liu,Yanda Li,Xiaowo Wang.Genomics.2020(2)
[2]Pathologic T-cell response in ischaemic failing hearts elucidated by T-cell receptor sequencing and phenotypic characterization.[J].Tang Ting-Ting,Zhu Yi-Cheng,Dong Nian-Guo,Zhang Si,Cai Jie,Zhang Ling-Xue,Han Yue,Xia Ni,Nie Shao-Fang,Zhang Min,Lv Bing-Jie,Jiao Jiao,Yang Xiang-Ping,Hu Yu,Liao Yu-Hua,Cheng Xiang.European heart journal.2019(48)
[3]Identification of patients and plaques vulnerable to future coronary events with near-infrared spectroscopy intravascular ultrasound imaging:a prospective,cohort study[J].Ron Waksman,Carlo Di Mario,Rebecca Torguson,Ziad A Ali,Varinder Singh,William H Skinner,Andre K Artis,Tim Ten Cate,Eric Powers,Christopher Kim,Evelyn Regar,S Chiu Wong,Stephen Lewis,Joanna Wykrzykowska,Sandeep Dube,Samer Kazziha,Martin van der Ent,Priti Shah,Paige E Craig,Quan Zou,Paul Kolm,H Bryan Brewer,Hector M Garcia-Garcia,Habib Samady,Jonathan Tobis,Mark Zainea,Wayne Leimbach,Daniel Lee,Thomas Lalonde,William Skinner,Augusto Villa,Henry Liberman,George Younis,Ranil de.The Lancet.2019(1020)
[4]Hematopoietic Npc1 mutation shifts gut microbiota composition in Ldlr-/-mice on a high-fat,high-cholesterol diet.[J].Houben Tom,Penders John,Oligschlaeger Yvonne,Dos Reis Inês A Magro,Bonder Marc-Jan,Koonen Debby P,Fu Jingyuan,Hofker Marten H,Shiri-Sverdlov Ronit.Scientific reports.2019(1)
[5]林颖.间充质干细胞对动脉粥样硬化斑块的作用及机制研究[D].宁波大学,2020.