背景[1-3]
高保真PCR扩增试剂盒是即用型的2×高保真PCR预配反应液，含有除引物、模板以外的所有PCR试剂，包括Pfu DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂、上样染料等，特别适合于高保真PCR反应。
产品特点：
1.Pfu DNA聚合酶是使用最广泛的高保真酶，其保真度为普通Taq酶的10倍。
2.使用时只需在加入模板和引物并稀释到1倍浓度即可进行PCR反应，非常方便，简化了PCR的准备工作。
3.PCR反应所必需试剂全集于一管之中，数分钟即可完成反应体系配置。由于加样过程少，有利于减少污染，降低实验误差。
4.本产品A型含电泳染料，PCR反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。
5.由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
6.适用于基因的高保真扩增和基因定点突变等实验，得到的PCR产物可用于平末端克隆。
高保真PCR扩增试剂盒
使用方法：
将本产品与用户自备的模板，引物混合液按推荐使用量(30μL反应体系)加入PCR管中即可进行PCR，反应结束后直接取5-15μL电泳检查扩增结果。
注意事项：
1.本产品的Pfu DNA聚合酶比Taq DNA聚合酶的延伸反应速率低，因此我们推荐的扩增延伸反应时间为每kb需2分种。
2.Pfu酶3′-5′外切酶活性可降解引物，所以强烈建议在冰上配置完成PCR反应液后，立即放入PCR仪中进行扩增，扩增完毕后立即进行电泳检测。
3.本产品扩增产物为平末端，不可以直接进行TA克隆，可以使用ClionB载体(BTN51104)进行克隆。如需要进行TA克隆，建议对PCR产物纯化后，用加A试剂盒(BTN60105)加A后再进行TA克隆。
4.由于Pfu无5′到3′外切酶的活性，所以本试剂盒不能用于实时荧光PCR。
应用[4][5]
用于高保真DNA聚合酶分子开关用于TP53基因热点突变的检测研究
利用硫化修饰的碱基特异性引物偶联高保真酶所构成的突变敏感性分子“开/关”系统检测TP53基因的热点突变（G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T）。同时结合实时荧光定量PCR技术，通过扩增曲线和熔解曲线准确、快速地判断6个热点突变的存在与否，并对突变进行半定量分析。
方法：将包含上述六个密码子的PCR产物克隆至pMD19-T载体，并转化至DH5α感受态细胞，通过LB/Amp/IPTG/X-gal平板筛选出白色克隆，利用载体通用引物和PCR引物对其进行菌液PCR初步鉴定，并通过测序分析进行确证，得到TP53基因的野生模板质粒。采用重叠延伸PCR技术，对所需位置的碱基进行定点突变，分别得到6种突变基因型PCR产物，克隆并用同样方法筛选出阳性克隆，经测序确证得到分别含有TP53基因G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T的突变质粒模板。
然后以这六个突变位点为检测靶点，分别设计3’末端与野生型基因位点或突变型基因位点配对的硫化修饰引物；利用高保真DNA聚合酶接到突变敏感性分子开关，对TP53基因野生型质粒模板和6种突变型质粒模板进行检测，并通过凝胶成像系统进行分析；采集正常人以及肿瘤患者的组织或血样标本，通过临床样本对检测方法进行评估，并对肿瘤样本进行TP53基因6个热点突变的筛查。
结合荧光定量PCR技术，评估高保真酶介导的敏感性分子开关在荧光定量PCR中的敏感性和相关性。结果：通过在不同的反应体系中分别对六个热点突变进行检测。
结果显示，在高保真DNA聚合酶介导的PCR反应体系中，仅完全配对引物得以延伸，不完全配对引物则不被延伸，即3’端硫化修饰突变检测引物仅对配对的突变模板有扩增产物，对野生模板无扩增产物。运用该检测方法对20例临床健康志愿者和29例癌症患者的组织及血样做检测，未发现TP53基因的G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T突变，检测结果与测序结果一致。
由此可以看出，突变敏感分子开关对体细胞突变的检测具有很好的特异性及敏感性。
结论：本研究充分利用高保真DNA聚合酶偶联硫化引物构成的突变敏感性分子开关成功开发出了可准确检出TP53基因175，245，248，249，273和282号密码子单碱基突变的新方法，并通过对不同类型的临床标本的检测，验证了其高敏感性和高效性。该技术除可用于检测血液基因组DNA的遗传性突变外，还可以检测血中游离DNA中存在的微量体细胞基因突变。该技术在TP53基因筛查中具有较大的潜在应用价值，能够对含有上述TP53基因的六个突变位点的某一具体癌症进行癌前诊断，产前诊断，预防和预后检测。
参考文献
[1]Non-melanoma skin cancer in mouse and man[J].Michael Schwarz,Peter A.Münzel,Albert Braeuning.Archives of Toxicology.2013(5)
[2]Tumor Protein p53（TP53）Testing and Li-Fraumeni Syndrome[J].April D.Sorrell,Carin R.Espenschied,Julie O.Culver,Jeffrey N.Weitzel.Molecular Diagnosis&Therapy.2013(1)
[3]Oncogene-and tumor suppressor gene-mediated suppression of cellular senescence[J].Lars-Gunnar Larsson.Seminars in Cancer Biology.2011(6)
[4]TP53 Mutations in Human Cancer:Database Reassessment and Prospects for the Next Decade[J].Thierry Soussi.Advances in Cancer Research.2011
[5]寇晓进.高保真DNA聚合酶分子开关用于TP53基因热点突变的检测[D].苏州大学,2013.