背景[1-3]
MG-63人骨肉瘤细胞源自14岁患有骨肉瘤的白人男性；聚次黄嘌呤核苷-聚胞嘧啶核苷酸、放线菌酮和D可以诱导MG-63细胞产生高水平的干扰素。MG-63细胞表达TGF-β受体Ⅰ和Ⅱ。
MG-63人骨肉瘤细胞
细胞培养步骤
一.培养基及培养冻存条件准备:
1)准备培养基;北美胎牛血清,10%;双抗1%。
2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。液氮储存。
二.细胞处理:
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
1.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
2.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
3.将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于斑蝥酸钠抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖的实验研究
斑蝥酸钠是抗癌活性比较普遍的一类斑蝥素衍生物,具有分子量小、易扩散、细胞毒性低、抗肿瘤效应强等优势,近几年在临床上得到广泛的应用。
研究方法:本实验以人骨肉瘤细胞系MG-63作为的研究对象,观察斑蝥酸钠对MG-63细胞的抑制作用,并用流式细胞检测MG-63的凋亡和细胞周期水平,应用MTT、Western-blotting、q RT-PCR、流式细胞术、RNA干扰技术等手段研究和阐明斑蝥酸钠诱导骨肉瘤细胞自噬、凋亡,阻滞细胞周期等作用与机制。实验结果:斑蝥酸钠作用于MG-63细胞后,MG-63细胞增殖受到明显抑制;细胞凋亡实验结果显示斑蝥酸钠可促进MG-63细胞的凋亡,细胞蛋白检测结果显示CASPASE-3活化被抑制。应用si RNA沉默Caspase-3基因后,斑蝥酸钠诱导的MG-63细胞凋亡作用明显被抑制。应用si RNA对LC3基因沉默后,斑蝥酸钠诱导MG-63细胞凋亡的能力也明显下降,且caspase-3活化比例降低。
细胞周期检测及蛋白检测实验发现斑蝥酸钠能够抑制MG-63细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK-4、CDK-6蛋白激酶的表达,从而导致细胞阻滞于G0/G1期。后续实验应用不同实验方法观察到斑蝥酸钠能够特异性提高AKT的磷酸化水平,从而影响AKT信号通路的激活。PI3K/AKT的抑制剂可以明显的抑制斑蝥酸钠引起的AKT信号通路的激活,进一步抑制了p53和p21的表达。沉默p53后抑制p21蛋白的活化,降低对细胞周期蛋白Cyclin D1和相应激酶CDK-4、CDK-6的抑制作用。
实验结论:斑蝥酸钠可以通过促进凋亡和阻滞细胞周期抑制人骨肉瘤细胞MG-63的增殖。斑蝥酸钠诱导MG-63细胞凋亡是通过LC3自噬途径引发,继而引起凋亡基因Caspase-3的活化,最终导致MG-63细胞的凋亡。同时,斑蝥酸钠激活MG-63细胞内PI3K/AKT信号通路,进而引起p53/p21的激活,抑制细胞周期蛋白Cyclin D1和蛋白激酶Cdk-4、Cdk-6的表达和活性,从而导致细胞阻滞于G0/G1期。
参考文献
[1]Conditional survival in pediatric malignancies:Analysis of data from the Childhood Cancer Survivor Study and the Surveillance,Epidemiology,and End Results Program[J].Ann C.Mertens,Jian Yong,Andrew C.Dietz,Erin Kreiter,Yutaka Yasui,Archie Bleyer,Gregory T.Armstrong,Leslie L.Robison,Karen Wasilewski‐Masker.Cancer.2015(7)
[2]Osteosarcoma survivors’risk of second cancer[J].Sanjeet Bagcchi.Lancet Oncology.2014(10)
[3]Childhood and adolescent cancer statistics,2014[J].Elizabeth Ward,Carol DeSantis,Anthony Robbins,Betsy Kohler,Ahmedin Jemal.CA A Cancer Journal for Clinicians.2014(2)
[4]International variations in childhood cancer in indigenous populations:a systematic review[J].Patricia C Valery,Suzanne P Moore,Judith Meiklejohn,Freddie Bray.Lancet Oncology.2014(2)
[5]刘公.斑蝥酸钠抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖的实验研究[D].吉林大学,2017.