背景[1-3]
人溶血磷脂酸(LPA)ELISA试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中溶血磷脂酸(LPA)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人溶血磷脂酸(LPA)水平。用纯化的人溶血磷脂酸(LPA)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入溶血磷脂酸(LPA),再与HRP标记的溶血磷脂酸(LPA)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的溶血磷脂酸(LPA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人溶血磷脂酸(LPA)浓度。
人溶血磷脂酸(LPA)ELISA试剂盒
操作步骤
1、取出试剂盒,室温(20-25℃)放置30分钟。
2、分组:取出96孔板,根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔,1个空白对照
3、标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100ul,然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100ul,弃掉。第六只试管作为0号标准品。
4、加样:依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中;空白对照孔加入50ul的蒸馏水;其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
5、温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
6、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒弃去,如此重复5次,拍干。
7、加酶标溶液:标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液(空白对照孔除外)。
8、温育:酶标板用封板纸密封后,放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。
9、洗板:用稀释后的洗涤液注满每孔,静置15-30s,充分清洗酶标板5次,用吸水纸彻底拍干。
10、显色:各孔加入显色剂A液50ul后,再加入显色剂B液50ul。
11、终止:25-37℃下避光反应10-15分钟,加入50ul终止液。
12、读板:在450nm波长读取各孔的OD值。
数据计算
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,即为样品的实际浓度。
应用[4][5]
用于LPA、HE4、CA125联检在上皮性卵巢癌诊断中的应用价值研究
通过检测恶性上皮性卵巢肿瘤患者、良性卵巢疾病患者、健康体检女性的血浆溶血磷脂酸、血清人附睾蛋白4和糖类抗原125的表达水平，以了解LPA、HE4作为卵巢肿瘤标志物能否与CA125相互补，以提高对卵巢恶性肿瘤检出率，尤其是对早期卵巢癌的诊断。
方法：收集接受治疗卵巢癌患者65例，卵巢良性肿瘤45例,及健康体检女性30例作为对照组。标本于晨起抽取所有研究对象的空腹静脉血，分别检测血中LPA、HE4、CA125水平。数据采用SPSSl3．O统计软件进行统计分析。
结果：1、卵巢癌组LPA范围为5.2--32.7umol/L；良性组范围为1.5--12.6umol／L；健康组范围为0.1--6.4umol／L。卵巢癌的LPA水平与良性组和健康组相比有差异（P＜0.05）。
2、卵巢癌组HE4范围为37.9--1315.5pmol/L；良性组范围为8.42--63.9pmol；健康组范围为2.6--49.8pmol/L。卵巢癌组的HE4水平与良性组和健康组相比，有显著性差异（P＜0.05）。
3、血浆LPA对卵巢癌诊断的灵敏度为80.4％，特异度为82.3%；HE4的灵敏度为77.8%，特异度为91.6%；三者联合检测的敏感度为79.2％，特异度为82.8%。表明三者联合检测可提高对卵巢癌的诊断。
4、血浆LPA水平在浆液性癌的阳性率为87.26%，粘液性癌的阳性率为81.25%，表明LPA与卵巢癌病理类型无明显相关性。血清HE4在浆液性癌的阳性率为80.39%，粘液性癌的阳性率为28.13%，表明HE4对浆液性癌有较好的诊断价值。
5、卵巢上皮癌患者HE4水平与CA125水平呈中度正相关性（rs=0.483，P＜0.05；）。卵巢上皮癌患者LPA水平与CA125水平呈低度正相关性（rs=0.242，P＞0.05；）
6、Ⅱ-Ⅳ期患者LPA及HE4水平较I期相比不断升高。LPA在I-IV期之间无显著性差异。HE4的水平随着临床分期的增高呈上升趋势。
结论:1、LPA、HE4单项检测诊断恶性卵巢肿瘤的特异性要优于CA125单项检测，三者联合检测可以提高上皮性卵巢癌的诊断能力。
2、LPA、HE4水平与CA125水平呈正相关，可以与CA125互补以提高卵巢癌的诊断水平。
3、LPA与卵巢癌病理类型无明显相关性。而HE4、CAl25水平与卵巢肿瘤的病理类型有关，浆液性癌患者较粘液性癌患者明显升高。
参考文献
[1]Detection of the HE4 protein in urine as a biomarker for ovarian neoplasms[J].Ingegerd Hellstrom,Patrick J.Heagerty,Elizabeth M.Swisher,Pu Liu,Jade Jaffar,Kathy Agnew,Karl Erik Hellstrom.Cancer Letters.2010(1)
[2]Ovarian Carcinoma Subtypes Are Different Diseases:Implications for Biomarker Studies[J].Martin K?bel,Steve E Kalloger,Niki Boyd,Steven McKinney,Erika Mehl,Chana Palmer,Samuel Leung,Nathan J Bowen,Diana N Ionescu,Ashish Rajput,Leah M Prentice,Dianne Miller,Jennifer Santos,Kenneth Swenerton,C.Blake Gilks,David Huntsman.PLOS Medicine.2008(12)
[3]Bead-based ELISA for validation of ovarian cancer early detection markers.[J].Scholler Nathalie,Crawford Meghan,Sato Alicia,Drescher Charles W,O’Briant Kathy C,Kiviat Nancy,Anderson Garnet L,Urban Nicole.Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research.2006(7 Pt)
[4]Human epididymis protein 4（HE4）is a secreted glycoprotein that is overexpressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas.[J].Drapkin Ronny,von Horsten Hans Henning,Lin Yafang,Mok Samuel C,Crum Christopher P,Welch William R,Hecht Jonathan L.Cancer research.2005(6)
[5]原琦.LPA、HE4、CA125联检在上皮性卵巢癌诊断中的应用价值[D].山西医科大学,2012.