背景[1]
烟草蚀纹病毒蛋白酶（Tobacco Etch Virus protease，TEVp）是一种高特异性、高保守的重要工程蛋白，其结构稳定性尤为重要；钴离子（Co2+）具有一定的生物毒性. 为了解Co2+对TEVp结构的影响，运用内源荧光方法和同步荧光方法探讨Co2+对TEVp结构的调控机理. 光谱显示Co2+对Recombinant Tobacco EV内源荧光有明显的淬灭作用，导致TEVp分子中色氨酸酪氨酸残基的疏水性增加. 在300 K和311 K温度条件下，淬灭常数Ksv分别为4.161 × 102 L/mol和2.129 × 102 L/mol，结合平衡常数KA分别为6.625 × 103 L/mol和5.132 × 103 L/mol，且动态荧光淬灭速率常数Kq远大于扩散碰撞淬灭速率常数的值2.0 × 1010 L mol-1 s-1，表明其淬灭机制属于静态淬灭. 吉布斯自由能ΔG < 0，焓值ΔH < 0且熵值ΔS > 0，表明Co2+与Recombinant Tobacco EV的相互作用能够自发进行，且它们之间的主要作用力类型为静电作用力.
Co2+对Recombinant Tobacco EV内源荧光的淬灭作用[2]
以往的光谱学研究发现，蛋白质的荧光性质与其氨基酸残基所处微环境的疏水性密切相关. Co2+对Recombinant Tobacco EV内源荧光发射光谱的影响见图1. 由图1A可知，pH为7.4、激发波长为278 nm时，Recombinant Tobacco EV的内源荧光发射峰约位于342.2 nm，表明荧光发色氨基酸如酪氨酸、色氨酸等残基位于TEVp分子内部疏水区. 随着Co2+的加入，光谱的荧光强度逐渐降低，Co2+对TEVp内源荧光有明显的淬灭作用.并且随着Co2+浓度增加，发射波长逐渐蓝移至约340 nm，表明荧光发色氨基酸如酪氨酸、色氨酸等残基周围微环境的疏水性增加，其周围结构更加紧密.
Co2+对Recombinant Tobacco EV荧光的淬灭方式[3]
因荧光淬灭机制不同，荧光淬灭过程通常有静态淬灭和动态淬灭两种方式，荧光激发态分子与淬灭剂之间的相互作用过程为动态淬灭. 此种淬灭的表征手段主要是温度越高，淬灭常数就随之增大. 由于淬灭剂与荧光体分子在基态形成不发光的配合物或分子间复合物，从而导致荧光体发光强度降低的过程为静态淬灭.因为在静态淬灭过程中产生了不发荧光的配合物，温度升高，配合物稳定性降低，其淬灭常数随之降低. 根据Stern-Volmer方程（公式1），计算了Recombinant Tobacco EV的荧光强度比值F0/F随Co2+浓度的变化，根据方程求得Stern-Volmer淬灭常数Ksv与动态荧光淬灭速率常数Kq， Ksv随温度的升高而降低，且Kq远大于扩散碰撞淬灭速率常数的值2.0 × 1010 L mol-1 s-1. 因此，Co2+对Recombinant Tobacco EV的荧光淬灭方式应为静态淬灭. 此结果类似于邢本刚等关于Co2+对蛋白质淬灭方式的判定。
参考文献
[1] 钴离子对烟草蚀纹病毒蛋白酶结构的影响
[2] 吕艳阳 , 翟秋阁 , 李 雪 , 陈 伟霞 . 荧 光 法 研 究四 ( 对甲氧 基 苯 基 )钴卟啉与牛血清白蛋白的相互作用[J]. 光谱实验室, 2010, 27 (3): 1169-1171 [Lü YY, Zhai QG, Li X, Chen WX. Interaction of meso-tetramethoxyphenyl porphyrin cobalt complexes with bovine serum albumin by fluorescence [J]. Chin J Spectrosc Lab, 2010, 27 (3): 1169-1171]
[3] 刘峥, 夏金虹, 刘宝玉, 金黎霞. 应用荧光光度法研究3,5-二溴水杨醛缩牛磺酸席夫碱与牛血清白蛋白相互作用[J]. 理化检验: 化分册, 2012, 46 (3): 270-275 [Liu Z, Xia JH, Liu BY, Jin LX. Study on interaction of 3, 5-dibromo-salicylaldehyde-taurine schiff base with BSA by fluorospectrophotometry [J]. Ptca (Part B Chem Anal), 2012, 46 (3): 270-275]