背景[1-3]
5-甲酰环连接酶抗体是一类可以特异性结合5-甲酰环连接酶的多克隆抗体，主要用于体外检测5-甲酰环连接酶的免疫学实验。
叶酸作为介导一碳代谢的重要辅因子,参与生物体内的多种代谢活动。5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(5FCL)被报道催化贮存形式的5-甲酰四氢叶酸(5-CHO-THF)向代谢活性形式的叶酸转化。
5-甲酰环连接酶
叶酸及其类似物甲酰四氢叶酸，常以多聚谷氨酸结合物（主要有碟酰三谷氨酸及碟酰七谷氨酸）的状态广泛分布于生物中，在正常情况下，它们皆可被小肠上皮细胞分泌的γ-L谷氨酸-羟基肽酶水解成谷氨酸和自由叶酸，自由型叶酸在小肠上部易于吸收，在体内的肠壁、肝、骨髓等组织中，在维生素C和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的参与下，叶酸可以转变为具有生理活性的5,6,7,8-四氢叶酸，其反应由叶酸还原酶来促进。
抗体是可溶性Y形球蛋白，响应于抗原的存在，由免疫系统的B细胞合成和分泌。具有可变区和高可变区的抗原结合位点（Fab）通常不考虑缀合，因为这会干扰表位的结合。而且，在铰链区的破坏使分子具有结合的灵活性，可能破坏抗原相互作用。因此，在制备抗体-缀合物时，必须尽可能保持Fab和铰链区不受干扰。
迄今为止，鉴定出的所有五类抗体-IgG，IgM，IgA，IgD和IgE已用于研究，诊断和治疗。
应用[4][5]
用于结核分枝杆菌叶酸代谢相关基因Rv0992c的性质及功能研究
通过生物信息学方法对M.tuberculosis H37Rv的未知功能基因Rv0992c的蛋白产物进行结构和功能的分析及预测,并对该基因进行克隆、表达及蛋白产物酶学活性研究。从之前对深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）的研究得知RruA1084基因编码5-甲酰基-四氢叶酸环连接酶（5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase,也称为次甲基-四氢叶酸合成酶,MTHFS）。
M.tuberculosis中Rv0992c基因是Rru A1084的同源物（二者的氨基酸序列具有32.7%的相似性和21.8%的同源性）,所以推测前者编码结核分枝杆菌的5-甲酰基-四氢叶酸环连接酶。从GenBank数据库中获得M.tuberculosis H37Rv的Rv0992c的核苷酸序列,设计对引物,以M.tuberculosis H37Rv全基因组为模板,PCR扩增获得Rv0992c基因。通过TA克隆,将PCR产物连接到pMD19-T Simple Vector上,之后亚克隆至载体pET28上,经菌落PCR,质粒酶切以及核苷酸序列测序证明了成功的构建了重组质粒pET28-Rv0992c。
重组质粒转化Escherichia coli BL21（DE3）,以温度、时间和IPTG浓度建立三因素三水平的正交实验,优化该重组蛋白质诱导表达条件。以表达条件（0.8mM的IPTG,25℃下诱导4h）进行扩大培养,Ni+凝胶亲和层析柱纯化获得高纯度的重组Rv0992c蛋白。纯化蛋白的酶学活性通过反应产物5,10-次甲基-四氢叶酸在355nm处吸光度的变化得到证实。运用Vector NTI 9,Swiss Model等生物信息学资源对结核分枝杆菌Rv0992c编码蛋白的基本性质进行了分析,包括对蛋白质等电点和分子量的预测,二级结构以及三级结构的预测分析。
结果表明：M.tuberculosis H37Rv Rv0992c基因编码蛋白分子量为21412.95Da,理论PI为9.40；二级结构是由3个α螺旋8个β折叠及无规则卷曲构成的。在一二级结构分析的基础上,利用同源建模的方法完成了其三维结构的建模。分析该蛋白在分枝杆菌属中的分布情况,结果显示M.tuberculosis H37Rv的MTHFS同已报道的其他分枝杆菌属来源的MTHFS有较高的同源性。
综上,本研究揭示了M.tuberculosis H37Rv Rv0992c序列编码蛋白具有将5-甲酰-四氢叶酸转化为5,10-次甲基-四氢叶酸的生物学功能。
参考文献
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[2]Investigations of the Roles of Arginine 115 and Lysine 120 in the Active Site of 5,10-Methenyltetrahydrofolate Synthetase from Mycoplasma pneumoniae[J].Amber N.Hancock,R.Shane Coleman,Richard T.Johnson,Catherine A.Sarisky,Timothy W.Johann.The Protein Journal.2008(5)
[3]5,10-Methenyltetrahydrofolate synthetase activity is increased in tumors and modifies the efficacy of antipurine LY309887[J].Martha S.Field,Montserrat C.Anguera,Rodney Page,Patrick J.Stover.Archives of Biochemistry and Biophysics.2008(2)
[4]Structure‐Based Design of a Potent and Selective Small Peptide Inhibitor of Mycobacterium tuberculosis 6‐Hydroxymethyl‐7,8‐Dihydropteroate Synthase:A Computer Modelling Approach[J].ManojKumar.Chemical Biology＆Drug Design.2008(6)
[5]侯曼美.结核分枝杆菌叶酸代谢相关基因Rv0992c的性质及功能研究[D].西南大学,2011.