背景[1-3]
小鼠对氨基苯甲酸(PABA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠对氨基苯甲酸(PABA)的含量。
实验原理:小鼠对氨基苯甲酸(PABA)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中对氨基苯甲酸(PABA)水平。用纯化的对氨基苯甲酸(PABA)(SHBG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化蛋白激酶C，再与HRP标记的磷酸化蛋白激酶C抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的对氨基苯甲酸(PABA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中对氨基苯甲酸(PABA)活性浓度。
小鼠对氨基苯甲酸(PABA)ELISA试剂盒
样本处理及要求：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）去除颗粒。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
操作程序
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔加待测样本50μL。
3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于组合代谢调控提高大肠杆菌对氨基苯甲酸产量研究
对氨基苯甲酸是一种广泛应用于医药和染料的小分子芳香族化合物。近几年的材料学研究表明对氨基苯甲酸具有成为高强度共聚物单体的潜力,可应用于材料表面处理,赋予材料表面抗菌的特性。市面上的对氨基苯甲酸主要来自化工合成,其生产过程污染严重,对环保造成了较大压力。
因此,对氨基苯甲酸及其衍生物的绿色生物合成是一种有潜力的生产策略。本研究以对氨基苯甲酸生物合成为目标,通过表达调控大肠杆菌对氨基苯甲酸合成酶系,构建和优化生产对氨基苯甲酸本甲酸的细胞工厂。通过对氨基苯甲酸合成酶系所涉及的pabA、pabB和pabC三个基因分别与低、中、高三种不同强度的组成型启动子进行组合,发现了对氨基苯甲酸积累量最高的表达组合;为了减少副产物酪氨酸的积累,对酪氨酸合成途径的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶（TyrA）进行了弱化调控,减少副产物积累的同时,显著提升了对氨基苯甲酸的积累量。最终在摇瓶发酵实验中取得了0.67 g/L的对氨基苯甲酸产量。
通过不同温度发酵实验,确定了对氨基苯甲酸的最适发酵温度。在5L发酵罐中进行分批补料发酵后获得了6.4 g/L的对氨基苯甲酸产量,是目前报道的大肠杆菌生产对氨基苯甲酸的最高产量。另外根据文献报道,本研究尝试根据进化树发掘对氨基苯甲酸合成新途径,初步结果发现来自β变形杆菌属中2个基因可以转化莽草酸途径的3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成对氨基苯甲酸。综上所述,本课题通过组合调控实验获得了目前有报道的的大肠杆菌生产对氨基苯甲酸的最高产量,同时,通过进化树分析验证了对氨基苯甲酸合成的新途径。
参考文献
[1]Production of para-aminobenzoate by genetically engineered Corynebacterium glutamicum and non-biological formation of an N-glucosyl byproduct[J].Takeshi Kubota,Akira Watanabe,Masako Suda,Takahisa Kogure,Kazumi Hiraga,Masayuki Inui.Metabolic Engineering.2016
[2]The return of metabolism:biochemistry and physiology of the pentose phosphate pathway[J].Anna Stincone,Alessandro Prigione,Thorsten Cramer,Mirjam M.C.Wamelink,Kate Campbell,Eric Cheung,Viridiana Olin‐Sandoval,Nana‐Maria Grüning,Antje Krüger,Mohammad Tauqeer Alam,Markus A.Keller,Michael Breitenbach,Kevin M.Brindle,Joshua D.Rabinowitz,Markus Ralser.Biological Reviews.2015(3)
[3]New gene responsible for para-aminobenzoate biosynthesis[J].Yasuharu Satoh,Masahiro Kuratsu,Daiki Kobayashi,Tohru Dairi.Journal of Bioscience and Bioengineering.2014(2)
[4]Production of p-Aminobenzoic acid by metabolically engineered Escherichia coli[J].Daisuke Koma,Hayato Yamanaka,Kunihiko Moriyoshi,Kiyofumi Sakai,Takaya Masuda,Yoshihiro Sato,Kozo Toida,Takashi Ohmoto.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry.2014(2)
[5]徐毅诚.组合代谢调控提高大肠杆菌对氨基苯甲酸产量[D].天津科技大学,2019.