背景[1-3]
人血清淀粉样蛋白A3(SAA3)ELISA KIT用于测定血清、血浆及相关液体样本中人血清淀粉样蛋白A3(SAA3)的活性及含量。
实验原理：用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
人血清淀粉样蛋白A3(SAA3)ELISA KIT
【样品收集、处理及保存】
1、细胞培养上清:
适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液,以1000×g离心15分钟,收集上清。
2、细胞:
用PBS反复洗涤细胞3次,调整细胞浓度达到104-106/ml左右,通过反复冻融,使细胞破坏并放出细胞内成份,或者细胞超声粉碎,离心取上清液检测。
3、血清:
在室温下,血液自然凝固,以1000×g离心15分钟,取上清待测。
4、血浆:
应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合后静置10-20分钟后,以1000×g离心15分钟,收集上清。
操作步骤
1、取出试剂盒,室温(20-25℃)放置30分钟。
2、分组:取出96孔板,根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔,1个空白对照
3、标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100ul,然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100ul,弃掉。第六只试管作为0号标准品。
4、加样:依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中;空白对照孔加入50ul的蒸馏水;其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
5、温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
6、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒弃去,如此重复5次,拍干。
7、加酶标溶液:标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液(空白对照孔除外)。
8、温育:酶标板用封板纸密封后,放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。
9、洗板:用稀释后的洗涤液注满每孔,静置15-30s,充分清洗酶标板5次,用吸水纸彻底拍干。
10、显色:各孔加入显色剂A液50ul后,再加入显色剂B液50ul。
11、终止:25-37℃下避光反应10-15分钟,加入50ul终止液。
12、读板:在450nm波长读取各孔的OD值。
注:读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹,读板时间控制在终止反应后的30分钟内,以免影响准确性。
数据计算
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,即为样品的实际浓度。
应用[4][5]
用于猪血清淀粉样蛋白3对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响研究
血清淀粉样蛋白3（Serum amyloid A3,SAA3）是干扰素诱导蛋白,也是机体感染的指标分子之一。但是,PRRSV感染过程中猪SAA3的变化及其对PRRSV复制的影响尚不清楚。
研究分析了PRRSV感染中SAA3的变化以及对PRRSV复制的影响,以期为研究PRRSV感染机制提供帮助。根据猪SAA3的全基因序列设计特异性扩增引物,扩增猪SAA3的开放阅读框区域。将扩增的基因的片段连接到Flag7.1空载体构建真核表达载体。将猪SAA3的氨基酸序列分别与人和小鼠的SAA家族序列进行比对,阐明猪SAA3蛋白的分子生物学特性和系统进化关系,并以此为依据合成猪SAA3抗原小肽,用于制备SAA3多克隆抗体。将合成的猪SAA3抗原小肽免疫兔制备多抗血清,并用ELISA方法检测多抗血清效价,利用Western-blot以及间接免疫荧光技术检测多抗血清的特异性和灵敏性。
结果显示,制备的多抗血清可以特异性识别猪源的SAA3蛋白。为了检测PRRSV感染过程中,PAM细胞以及猪各个组织中SAA3的RNA水平和蛋白水平的变化。将PRRSV感染PAM细胞,在不同时间点提取RNA,用相对荧光定量PCR的方法检测SAA3 mRNA的动态变化。将PRRSV感染30日龄SPF猪,收取各个组织,分别在RNA和蛋白水平检测SAA3的变化。
结果显示,在PAM细胞中,接毒组在12小时以后,SAA3 mRNA水平明显高于对照组。在猪各个组织中,接毒组各组织SAA3 mRNA水平都有不同程度的升高,其中肺脏升高最为明显,约是对照组的200倍。Western-blot结果发现,接毒组的肺脏、肾脏等的SAA3蛋白水平明显高于对照组,说明PRRSV感染时SAA3在机体各组织的表达会产生明显差异。为了研究猪SAA3蛋白对PRRSV感染的影响,利用过表达猪SAA3以及外源加入SAA蛋白的方法来检测SAA3对PRRSV复制的影响。荧光定量PCR结果显示,过表达猪SAA3能够显著提高PRRSV mRNA复制水平。
TCID50的结果表明,猪SAA3表达组的PRRSV滴度显著高于空载体对照组。分析SAA对病毒感染阶段的影响发现,外源加入SAA蛋白能够促进病毒对宿主细胞的吸附作用。
综上所述,本研究对猪SAA3进行了克隆、表达和抗体制备,分析了PRRSV感染对猪SAA3表达的影响及其生物学意义,发现了PRRSV可上调猪SAA3表达,SAA3能够促进PRRSV病毒复制和宿主细胞的吸附。
参考文献
[1]The cytokine-serum amyloid A-chemokine network[J].Mieke De Buck,Mieke Gouwy,Ji Ming Wang,Jacques Van Snick,Paul Proost,Sofie Struyf,Jo Van Damme.Cytokine and Growth Factor Reviews.2015
[2]Serum amyloid A induces interleukin‐1βsecretion from keratinocytes via the NACHT,LRR and PYD domains‐containing protein 3 inflammasome[J].N.Yu,S.Liu,X.Yi,S.Zhang,Y.Ding.Clin Exp Immunol.2015(2)
[3]Serum amyloid A induces interleukin‐6 in dermal fibroblasts via T oll‐like receptor 2,interleukin‐1 receptor‐associated kinase 4 and nuclear factor‐κB[J].Steven O’Reilly,Rachel Cant,Marzena Ciechomska,James Finnigan,Fiona Oakley,Sophie Hambleton,Jacob M.Laar.Immunology.2014(3)
[4]Serum amyloid A induces interleukin‐33 expression through an IRF7‐dependent pathway[J].Lei Sun,Ziyan Zhu,Ni Cheng,Qian Yan,Richard D.Ye.Eur.J.Immunol..2014(7)
[5]郇贝丽.猪血清淀粉样蛋白3对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响[D].中国农业科学院,2017.