背景[1-3]
核-胞浆蛋白制备试剂盒(NUCLEAR-CYTOSOL EXTRACTION KIT)可以从哺乳动物细胞中分离细胞核和胞浆组分。此试剂盒提供了一个系统，维持核和胞浆组分是分开和完整的。优化的试剂配方和程序可以快速分离胞核和胞浆，而几乎没有交叉污染。本试剂盒提取的胞核和胞浆组分仍保持其生化功能，适合下游分析如转录活性，RNA拼接，gel－shift分析，报告分析，酶活性分析和WB等。
操作步骤:
1.裂解：(1)培养细胞，PBS洗涤细胞两次，根据细胞计数，或者估计离心后的细胞体积PCV。每1×106个细胞加入50~100ul的CEB-A，刮下细胞转移至预冷的1.5ml离心管；或者每体积PCV细胞加入5倍PCV体积的CEB-A(即10~20 ul PCV的细胞加50~100ul的CEB-A)，剧烈振荡重悬。
裂解:(2)组织样本，精确称重后剪成小块，PBS洗涤。通常每10mg动物组织相当于1×106个细胞，需加入50~100ul CEB-A，参照上表按比例加入。在冰上使用玻璃匀浆器匀浆组织，通常需要20~40次上下抽动匀浆，弃去筋膜组织。切记勿用高速电动匀浆器或超声破碎组织避免破坏细胞器结构。
2.裂解产物转移至预冷的1.5ml离心管，剧烈振荡30秒，冰浴10~15min，期间每5分钟振荡15秒。
3.可选步骤：根据步骤2裂解物体积，加入1/20体积的CEB-B，振荡10秒，冰浴1min(加入CEB-B可去除部分核膜蛋白，适于制备高纯度的核蛋白用于EMSA凝胶阻滞实验等，但可使胞浆蛋白出现很少量的膜蛋白污染。若制备高纯度胞浆蛋白可跳过此步骤。若制备核蛋白仅用于普通的WesternBlot目的，则无须高纯度核蛋白，也可省略此步骤。
4.胞浆蛋白组分的制备：将步骤2或步骤3的上清，12000g 4oC离心5min，勿触动沉淀，将上清转移到新管，此即胞浆蛋白组分，可立即使用或−20~−70ºC保存。
5.胞核粗提组分的制备：取第步骤4的原离心管，12000g 4oC瞬时离心，尽量吸除上清，保留沉淀。加入100ulCEB-A和5ulCEB-B，振荡10秒，重悬沉淀，冰浴1min，1000g 5min，弃上清。再次加入100ulCEB-A和5ulCEB-B重悬沉淀冰浴1min,1000g 5min，尽弃上清，保留沉淀。
6.胞核蛋白的制备：加50~100ul预冷NEB重悬步骤5的离心沉淀，剧烈振荡15秒，冰上30min，期间每10min振荡15秒。12000g 5min，上清液含核蛋白成分，其中含有25%的甘油；可立即使用或−20~−70ºC保存。
应用[4][5]
用于钙依赖性的蛋白水解酶Calpain在对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤中的作用及其机制研究
对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）是临床常用的解热镇痛类非处方药。过量服用APAP会引起严重的急性肝损伤,最终诱发急性肝衰竭。线粒体损伤被认为是APAP肝毒性中的关键事件,它不仅影响ATP生成,还可引起肝细胞内的钙稳态失衡以及激活炎性反应进一步加重肝脏损伤。
通过建立APAP剂量-反应关系模型和Calpain抑制剂ALLN干预模型,检测肝脏中Calpain降解系统、线粒体动态、线粒体自噬相关蛋白及NF-κB-NLRP3信号通路的变化,探讨Calpain在APAP肝损伤中的作用及其分子机制。
研究方法1动物模型建立（1）APAP小鼠肝损伤的剂量-反应关系模型:适应性喂养雄性C57/BL 6小鼠3天后,选取40只随机分为4组:对照组、APAP低剂量组（180 mg/kg.bw）、中剂量组（300mg/kg.bw）和高剂量组（500 mg/kg.bw）。禁食12 h后,采用腹腔注射的方式给予小鼠APAP溶液,对照组小鼠注射生理盐水。给药24h后,摘眼球取血并摘取小鼠肝脏组织。
APAP小鼠肝损伤的ALLN干预模型:适应性喂养雄性C57/BL 6小鼠3天后,选取40只随机分为4组:对照组、ALLN组、APAP组、ALLN+APAP组,每组10只小鼠。禁食12h后,采用腹腔注射的方式给予对照组生理盐水,ALLN干预组注射20 mg/kg.bw ALLN溶液,APAP组腹腔注射300 mg/kg.bw APAP溶液,ALLN干预组提前1 h以20 mg/kg.bw剂量腹腔注射ALLN溶液后给予300mg/kg.bw APAP,24h后摘眼球取血和肝脏组织。2生化指标、肝脏病理、Calpain活性及蛋白表达水平的检测
检测小鼠血清中的ALT、AST,称取肝重并计算肝脏系数,剪取同一位置的肝脏依次进行病理切片、HE染色,检测病理损伤。
APAP剂量-反应模型小鼠匀浆肝组织后,提取总蛋白,采用Western Blot技术检测Calpain相关蛋白的表达。
ALLN干预模型小鼠匀浆肝脏组织后,用GENMED组织钙蛋白酶（Calpain）活性荧光定量检测试剂盒检测Calpain活性改变,并分别提取总蛋白、线粒体蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白,利用Western Blot检测Calpain相关蛋白、线粒体动态相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白及炎症相关蛋白的表达变化。
3透射电镜观察线粒体损伤取小鼠肝脏同一部位组织1mm3,迅速浸入预冷的3%戊二醛固定液,2h。浸洗后固定于1%OsO4,1h,经乙醇梯度脱水后包埋于Epon812树脂。用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对小鼠肝脏超薄切片进行双重染色,然后用JEOL-1200EX透射电子显微镜观察并选取视野进行拍照。
4对肝组织进行免疫荧光染色常规制备小鼠肝脏石蜡切片,小鼠肝脏（5μm）的石蜡切片进行脱蜡和水化处理。然后,将切片浸入柠檬酸盐缓冲液中并微波加热至92℃持续10 min进行抗原修复。为了进行免疫荧光染色,首先用0.3%TritonX-100室温透膜10 min,再将切片用5%BSA室温封闭30 min,然后与一抗孵育过夜。第二天,将切片与荧光二抗在室温下避光孵育1-1.5 h。细胞核用Hoechst 33343染色,并用SlowFade Antifade Mountant进行封片处理。最后,用尼康荧光显微镜观察染色的切片并选取视野进行拍照。
参考文献
[1]Protective effect of an L-type calcium channel blocker,amlodipine,on paracetamol-induced hepatotoxicity in rats[J].Kaya H,Polat B,Albayrak A,Mercantepe T,Buyuk B.Human and Experimental Toxicology.2018(11)
[2]A Membrane Potential-and Calpain-Dependent Reversal of Caspase-1 Inhibition Regulates Canonical NLRP3 Inflammasome[J].Yifei Zhang,Hua Rong,Fang-Xiong Zhang,Kun Wu,Libing Mu,Junchen Meng,Bailong Xiao,Gerald W.Zamponi,Yan Shi.Cell Reports.2018(9)
[3]Activation of p62-keap1-Nrf2 antioxidant pathway in the early stage of acetaminophen-induced acute liver injury in mice[J].Zhenyu Shen,Yu Wang,Zhenhui Su,Ruirui Kou,Keqin Xie,Fuyong Song.Chemico-Biological Interactions.2018
[4]Mitochondrial Dynamics at the Interface of Immune Cell Metabolism and Function[J].Angelika S.Rambold,Erika L.Pearce.Trends in Immunology.2018(1)
[5]单淑林.钙依赖性的蛋白水解酶Calpain在对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤中的作用及其机制研究[D].山东大学,2020.