背景[1-3]
人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)ELISA KIT用于检测血清、组织等多种样本中人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的含量。
检测原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被样本抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的样本呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)
样品收集、处理及保存方法
1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
应用[4][5]
用于基质金属蛋白酶-9（MMP-9）对AT1a（Agtr1a）基因敲除小鼠血压及心室重构影响的研究
利用Agtr1a基因敲除鼠模型,通过注射外源性MMP-9和腺相关病毒（AAV9）为载体致内源性MMP-9高表达的方法,探讨MMP-9是否可独立于AngⅡ-Agtr1通路导致血压升高及心室重构。为高血压及心室重构的发病机制提供新的认识,为治疗高血压及心室重构预防及治疗靶点提供理论支持。
方法:1、实验动物:Agtr1a（-/-）雄鼠与Agtr1a（+/+）雌鼠两者繁育得到Agtr1a（+/-）,随后使用同代Agtr1a（+/-）雌雄共同繁育,通过基因型鉴定,得到Agtr1a（+/+）、Agtr1a（-/-）,采用F5代的8周龄的Agtr1a（+/+）、Agtr1a（-/-）用于尾静脉注射外源性重组小鼠MMP-9蛋白。F6代的8周龄的Agtr1a（+/+）、Agtr1a（-/-）用于AAV9内源性过表达MMP-9蛋白。内源性高表达MMP-9使用构建cTNT启动心肌细胞特异性过表达MMP-9腺相关病毒（AAV9）的方法实现,每组均雌雄各半。
2、动物分组及处理:（1）.外源性MMP-9蛋白输注组:按Agtr1a（+/+）及Agtr1a（-/-）分别按小鼠体重及雌雄分层随机分为Agtr1a（+/+）对照组（下文称WT control组）、Agtr1a（+/+）低剂量组（下文称WT 5μg/Kg组）、Agtr1a（+/+）高剂量组（下文称WT 10μg/Kg组）,Agtr1a（-/-）对照组（下文称KO control组）、Agtr1a（-/-）低剂量组（以下称KO 5μg/Kg组）、Agtr1a（-/-）高剂量组（下文称KO 10μg/Kg组）,6只/组,WT control组及KO control尾静脉注射生理盐水200μl,WT 5μg/kg及KO 5μg/kg尾静脉注射重组小鼠MMP-9蛋白5μg/kg+生理盐水共200μl,WT 10μg/kg及KO 10μg/k组尾静脉注射MMP-9蛋白10μg/kg+生理盐水共200μl,biw（每周一、周四）。
（2）.内源性MMP-9蛋白过表达组:Agtr1a（+/+）及Agtr1a（-/-）小鼠均按体重及雌雄分层随机分为Agtr1a（+/+）AAV9空载对照组（以下称WT AAV9 control）,Agtr1a（+/+）AAV9-MMP-9过表达组（以下称WT AAV9-MMP-9组）,Agtr1a（-/-）AAV9空载对照组（以下称KO AAV9 control组）,Agtr1a（-/-）AAV9-MMP-9过表达组（以下称KO AAV9-MMP-9组）,6只/组,WT AAV9 control以及KO AAV9 control组尾静脉注射AAV9空载病毒100μl,WT AAV9-MMP-9组、KO AAV9-MMP-9组尾静脉注射AAV9-MMP-9 100μl。
3、观察项目:外源性MMP-9蛋白输注组及内源性MMP-9蛋白过表达组观察及检测项目如下:监测体重变化,每组小鼠初始血压,第八周末测定血压值;通过心脏超声测量左室舒张末期前壁厚度（LVAW d）、左室收缩末期前壁厚度（LVAW s）、左室舒张末期后壁厚度（LVPW d）、左室收缩末期后壁厚度（LVPW s）、左室舒张末期内径（LVID d）、左室收缩末期内径（LVID s）、左室重量（LV mass）、射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）、左室舒张早期快速充盈的充盈峰E峰/舒张晚期（心房收缩）充盈的充盈峰A峰（E/A值）、左室舒张末期容积（LV vol d）、左室收缩末期容积（LV vol s）;麻醉后眼球取血,取左心室,计算左室重量指数（LWVI）=左心室重量/小鼠体重;心肌病理切片HE、Masson、天狼猩红染色判断心肌细胞形态、结构、心肌胶原的变化;通过心肌MMP-9免疫荧光染色观察心肌内MMP-9蛋白定位、定量;腹主动脉及肠系膜动脉HE、Masson观察血管形态及胶原容积分数;ELISA测定血中MMP-9、TIMP-1、ACE、AngⅡ、ACE2、Ang（1-7）、ET-1、eNOS含量,Western blot测定心肌中MMP-9、TIMP-1蛋白含量,Real Time-PCR测得心肌中MMP-9 mRNA、TIMP-1mRNA。
参考文献
[1]Hypertension-induced changes in the rat myocardium during the development of cardiac hypertrophy–a comparison between the left and the right ventricle[J].Alexandar Iliev,Georgi Kotov,Iva N.Dimitrova,Boycho Landzhov.Acta Histochemica.2018
[2]Resistant Hypertension:An Update of Experimental and Clinical Findings[J].Anping Cai,David A.Calhoun.Hypertension.2017(1)
[3]Angiotensin Receptor Blockers Do Not Reduce Risk of Myocardial Infarction,Cardiovascular Death,or Total Mortality:Further Evidence for the ARB-MI Paradox[J].Martin H.Strauss,Alistair S.Hall.Circulation.2017(22)
[4]Decline in Cardiovascular Mortality:Possible Causes and Implications[J].George A.Mensah,Gina S.Wei,Paul D.Sorlie,Lawrence J.Fine,Yves Rosenberg,Peter G.Kaufmann,Michael E.Mussolino,Lucy L.Hsu,Ebyan Addou,Michael M.Engelgau,David Gordon.Circulation Research.2017(2)
[5]胡思妙.基质金属蛋白酶-9（MMP-9）对AT1a（Agtr1a）基因敲除小鼠血压及心室重构影响的研究[D].广东药科大学,2020.