背景[1-3]
二氢叶酸还原酶抗体是一类可以特异性结合二氢叶酸还原酶的多克隆抗体，主要用于体外检测二氢叶酸还原酶的免疫学实验。
二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是利用NADPH还原二氢叶酸产生四氢叶酸的氧化还原酶。存在于微生物和肝脏中的二氢叶酸还原酶曾有所细致的研究。分子量约为2万。似乎也有催化叶酸使之还原成二氢叶酸的作用，所以可将叶酸成为该酶辅酶的活性型的四氢叶酸。在核酸合成旺盛的白血病患者的白血球中含量很多，而其抗癌药氨[基]蝶呤（4-氨基蝶酰[基]谷氨酸）等的作用机理，可能是因为在低浓度（10-8M）下可抑制此酶而抑制核酸的合成。
二氢叶酸还原酶
二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）是叶酸代谢中的关键酶之一，利用NADPH还原二氢叶酸产生四氢叶酸，近年来广泛应用于抗炎、肿瘤及感染性疾病的研究。
非甾体抗炎药（NSAIDs）主要是通过靶向环氧合酶(COX1/2)来干扰类二十烷酸的生物合成。该类药物在类风湿性关节炎及其他自身免疫性疾病治疗方面具有重要作用。除了非甾体抗炎药，抗叶酸药物磺胺嘧啶和甲氨蝶呤也是治疗类风湿性关节炎和其他慢性炎症相关疾病的有效药物。
含有苯甲酸或水杨酸基团的非甾体抗炎药亲和力较高，具有抗叶酸作用。同时，NSAIDs-DHFR共晶结构的揭示了其在pABG位点的结合特征。这为非甾体抗炎药作为多靶抗炎药物的设计和发现提供了思路。
应用[4][5]
二氢叶酸还原酶抗体可以用于氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞株二氢叶酸还原酶的基因与蛋白水平表达分析
研究MTX对映体(L-(+)-MTX和D-(–)-MTX)耐药与二氢叶酸还原酶(DHFR)基因水平表达的关系。
方法:采用浓度递增结合低剂量持续诱导方法获得不同构型及不同浓度的MTX对映体对A549细胞的耐药细胞株,应用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)检测不同构型及不同浓度MTX对映体耐药细胞株中DHFR基因表达的变化。
结果:两种对映体获得性耐药存在差异,D型耐药细胞耐药指数高于L型;对映体各浓度耐药细胞间耐药指数也有差异。L型、D型MTX首次诱导15μmol/L耐药细胞的DHFR基因表达低于亲本细胞,该浓度对映体耐药细胞组间没有差别。35-45μmol/L浓度耐药细胞的DHFR基因表达增加,D型45μmol/L耐药细胞DHFR基因表达高于对应浓度L型耐药细胞的表达(P<0.05)。两对映体细胞株间有明显手性差异。
结论:首次诱导耐药以抑制DHFR表达为主,35-45μmol/L浓度耐药细胞的DHFR基因表达随细胞耐药性的增加而增加,45μmol/L浓度耐药细胞的DHFR基因表达具有手性差别。这提示DHFR基因表达的检测可能可作为肿瘤治疗监测的指标,氨甲蝶呤制剂中D型组分不能简单当成污染物而忽视,我们应尽量选用单一对映体的L-MTX药物制剂。
研究MTX对映体(L-(+)-MTX和D-(–)-MTX)耐药与二氢叶酸还原酶(DHFR)蛋白水平表达的关系并建立从非小细胞肺癌A549亲本细胞株提取纯化二氢叶酸还原酶的方法。
方法:应用蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测不同构型及不同浓度MTX对映体耐药细胞株中DHFR蛋白表达的变化。A549亲本细胞株二氢叶酸还原酶的提取流程为:细胞粗提液的制取→PH5.0等电点沉淀→硫酸铵沉淀→超滤→DEAE-sepharose Fast Flow阴离子交换层析→超滤等步骤。所得蛋白用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,蛋白免疫印迹试验(Western blot)验证,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,酶反应测定其活性。结果:15μmol/L耐药细胞的DHFR蛋白表达低于亲本细胞,35-45μmol/L浓度耐药细胞的DHFR蛋白表达增加,D型45μmol/L耐药细胞DHFR蛋白表达高于对应浓度L型耐药细胞的表达(P<0.05)。两对映体细胞株间有明显手性差异。成功提取并纯化A549亲本细胞株二氢叶酸还原酶,SDS-PAGE电泳显示酶得到了高度纯化,纯化后蛋白经Western blot分析,见特异反应带。
结论:D型45μmol/L耐药细胞DHFR蛋白表达明显增强,提示其在MTX对映体手性耐药机制中起重要作用。使用本流程可纯化得到较高纯度的二氢叶酸还原酶,为进一步研究MTX对映体的手性耐药机制奠定基础。
参考文献
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[5]李道静.氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞株二氢叶酸还原酶的基因与蛋白水平表达分析[D].安徽医科大学,2011.