背景[1-3]
CCK试剂盒即Cell Counting Kit是MTT法的替代方法，是一种基于WST（水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐），广泛应于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
CCK试剂盒
操作说明：
A．制作标准曲线（测定细胞具体数量时）
1）、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2）、按比例（如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3）、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。）
B．细胞活性检测
1）、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在37℃,5%CO2的条件下）。
2）、向每孔加入10μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
3）、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4）、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
5）、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
C．细胞增值-毒性检测
1）、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37℃，5%CO2的条件下）。
2）、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。
3）、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
4）、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
5）、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6）、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7）、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
应用[4][5]
CCK试剂盒可以用于SCD1促进低氧乏养胰腺癌细胞铁死亡抵抗作用及机制研究
探讨胰腺癌H/NS的微环境下,SCD1对胰腺癌细胞铁死亡调控的分子机制,为诱导胰腺癌细胞铁死亡提供新的治疗策略。
研究方法:(1)CCK-8法检测Erastin、RSL3、柳氮磺胺吡啶对胰腺癌细胞铁死亡的作用;显微镜下观察细胞数量及形态;CCK-8法检测H/NS培养条件下铁死亡诱导剂(Erastin、RSL3、柳氮磺胺吡啶)处理24 h后PANC1和Patu8988细胞的活性。丙二醛(MDA)检测试剂盒测定细胞内MDA水平。
(2) 蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测转染GPX4 sh RNA的PANC1细胞中GPX4蛋白表达水平和CCK-8法检测转染GPX4 sh RNA的PANC1细胞H/NS下培养24 h后的细胞活性。
(3) 应用生物信息学方法分析SCD1在胰腺癌中的表达及临床意义。荧光定量PCR和Western blot检测H/NS下,胰腺癌细胞(PANC1、Patu8988、BXPC3、SW1990)中SCD1的表达量。
(4) 应用人单不饱和脂肪酸(MNSFA)ELISA试剂盒检测H/NS下PANC1和Patu8988中单不饱和脂肪酸(MUFAs)的含量。
(5) TCGA数据库分析胰腺癌组织中SCD1与铁死亡相关基因的相关性。荧光显微镜、Western blot及q RT-PCR验证SCD1在人胰腺癌细胞PANC1和Patu8988中的干扰效率。SYTOX Green染色、CCK-8法检测H/NS下,干扰SCD1对PANC1和Patu8988细胞铁死亡的影响。MNSFA ELISA试剂盒检测H/NS下,干扰SCD1对人胰腺癌细胞株PANC1和Patu8988中MUFAs含量的影响。
(6) MDA检测试剂盒检测H/NS下,Erastin处理后干扰SCD1的PANC1和Patu8988细胞MDA水平的变化。细胞核染料PI染色、CCK-8法检测SCD1抑制剂A939572与Erastin联用对胰腺癌细胞活性的影响。BODIPY-C11581/591染色检测不同处理组:DMSO组、Erastin组、A939572组、Erastin+A939572组的PANC1细胞的脂质过氧化程度并拍摄图片。
(7) 构建鼠源性胰腺癌细胞Panc02皮下瘤模型,随机分为DMSO组、Erastin组、A939572组、Erastin+A939572组。测量每组小鼠肿瘤体积,治疗14天后解剖皮下瘤测量每组肿瘤大小。裂解皮下瘤组织,MDA检测试剂盒检测各处理组小鼠肿瘤组织的MDA水平。
研究结果:(1)CCK-8法结果显示Erastin、RSL3、柳氮磺胺吡啶诱导胰腺癌细胞铁死亡。显微镜观察和CCK-8检测结果均证明与正常培养条件下(Nor)相比,H/NS可以诱导PANC1和Patu8988细胞的铁死亡抵抗,且PANC1和Patu8988细胞MDA水平下降。
(2)Western blot结果显示:干扰GPX4的PANC1细胞GPX4蛋白表达和细胞活力明显降低,而在H/NS条件下,细胞活力几乎没有变化。
参考文献
[1]Concurrent Mutations in STK11 and KEAP1 Promote Ferroptosis Protection and SCD1 Dependence in Lung Cancer[J].Wohlhieter Corrin A.;Richards Allison L.;Uddin Fathema;Hulton Christopher H.;Quintanal-Villalongaàlvaro;Martin Axel;de Stanchina Elisa;Bhanot Umeshkumar;Asher Marina;Shah Nisargbhai S.;Hayatt Omar;Buonocore Darren J.;Rekhtman Natasha;Shen Ronglai;Arbour Kathryn C.;Donoghue Mark;Poirier John T.;Sen Triparna;Rudin Charles M..Cell Reports,2020(9)
[2]Ferroptosis:Final destination for cancer?[J].Ye Zeng;;Liu Wensheng;;Zhuo Qifeng;;Hu Qiangsheng;;Liu Mengqi;;Sun Qiqing;;Zhang Zheng;;Fan Guixiong;;Xu Wenyan;;Ji Shunrong;;Yu Xianjun;;Qin Yi;;Xu Xiaowu.Cell proliferation,2020(3)
[3]Endocytosis of very low-density lipoproteins:an unexpected mechanism for lipid acquisition by breast cancer cells.[J].Lupien Leslie E;;Bloch Katarzyna;;Dehairs Jonas;;Traphagen Nicole A;;Feng William W;;Davis Wilson L;;Dennis Thea;;Swinnen Johannes V;;Wells Wendy A;;Smits Nicole C;;Kuemmerle Nancy B;;Miller Todd W;;Kinlaw William B.Journal of lipid research,2020(2)
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[5]高洁.SCD1促进低氧乏养胰腺癌细胞铁死亡抵抗作用及机制研究[D].江苏大学,2021.