背景[1-3]
T24人膀胱移行细胞源自一位81岁白人女性患者的膀胱移行细胞癌组织；来源于移行细胞癌病人的白血病和血浆对T24和相关细胞株有细胞毒性；倍增时间为19小时；含ras(H-ras)癌基因,表达肿瘤特有抗原。
T24人膀胱移行细胞
T24人膀胱移行细胞细胞培养步骤：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
传代方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
T24人膀胱移行细胞可以用于HIF-1α特异性抑制剂YC-1对缺氧条件下人膀胱癌细胞株T24细胞生物学行为的影响
YC-1对缺氧T24细胞中HIF-1α基因的mRNA及蛋白表达的影响
探讨YC-1作用于缺氧T24细胞后,对其HIF-1α基因的mRNA及蛋白表达的影响。
方法：设定不同浓度的YC-1(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L 50μmol/L,100μmol/L)作用于缺氧T24细胞12h、24h和48h(0μmol/L 12h组为对照组),半定量RT-PCR检测T24细胞中HIF-1αmRNA的变化,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达。
结果：半定量RT-PCR和Western blot检测,不同浓度(0μmol/L 1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)YC-1于缺氧T24细胞不同时间(12h,24h,48h)后,均降低HIF-1αmRNA表达比值和其蛋白表达比值。不同浓度(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)YC-1作用12h时HIF-1αmRNA表达比值(HIF-1α/GAPDH)分别为1.258±0.049,1.019±0.014,0.866±0.034,0.580±0.018,0.460±0.024；作用24h时分别为1.439±0.050,0.983+0.030,0.667±0.026,0.406±0.041,0.387±0.018；作用48h时分别为1.516±0.036,0.731±0.032,0.615±0.034,0.351±0.0240.317±0.019,各时间点不同浓度组与对照组比较均有下调,并且呈明显的时间和剂量效应关系(P<0.01)；Western blot检测,不同浓度(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)YC-1作用12h时,HIF-1α蛋白表达比值(HIF-1α/GAPDH)分别为0.192±0.003,0.176±0.004,0.115±0.003,0.075±0.002,0.056±0.003；作用24h时,分别为0.203±0.004,0.150±0.003,0.088±0.003,0.055±0.004,0.035+0.002；作用48h时,分别为0.243±0.005,0.149±0.003,0.069±0.003,0.040±0.002,0.032±0.002,各时间点不同浓度组与对照组比较均有下调,并且呈明显的时间和剂量效应关系(P<0.01)。
结论：YC-1能抑制缺氧T24细胞中HIF-1α基因mRNA及其蛋白的表达,并且呈明显的时间和剂量效应关系。
YC-1作用于缺氧T24细胞后,对其HIF-1α介导的基因及其生物学行为,包括细胞存活率、凋亡率、侵袭力等的影响。
方法：设定不同浓度的YC-1(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)作用于缺氧T24细胞48h后,Western blot检测VEGF.MMP-2.Bcl-2蛋白的表达,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell侵袭小室法检测细胞侵袭能力。
结果：不同浓度的YC-1(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)作用于缺氧T24细胞48h后,VEGF蛋白表达比值(VEGF/GAPDH)分别为0.496±0.004,0.391±0.003,0.319±0.002,0.290±0.003,0.171±0.003；MMP-2蛋白表达比值(MMP-2/GAPDH)分别为0.611±0.006,0.435±0.003,0.323±0.002,0.298±0.002,0.231±0.003；Bcl-2蛋白表达比值(Bcl-2/GAPDH)分别为0.396±0.006,0.266±0.003,0.198±0.003,0.156±0.003,0.089±0.003,呈明显的剂量效应关系(P<0.01)。不同浓度的YC-1(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)作用于缺氧T24细胞48h后,MTT法检测细胞存活率分别为100%,94.17%±1.18%,85.55%±1.20%,82.81%±1.27%,77.33%±0.99%；流式细胞术检测细胞凋亡率分别为5.55%±1.32%,6.55%±1.35%,9.05%±1.54%,11.83%±2.78%,16.05%+2.26%；Transwell侵袭小室法检测细胞侵袭能力,平均迁移细胞数分别为54.0+4.0,48.2+4.7,41.4+4.4,31.4+3.8,25.8+5.3,均呈明显的剂量效应关系(P<0.01)。
参考文献
[1]The Updated EAU Guidelines on Muscle-Invasive and Metastatic Bladder Cancer[J].Arnulf Stenzl;;Nigel C.Cowan;;Maria De Santis;;Gerhard Jakse;;Marcus A.Kuczyk;;Axel S.Merseburger;;Maria JoséRibal;;Amir Sherif;;J.Alfred Witjes.European Urology,2009(4)
[2]Evaluation of relationship between HIF-1αimmunoreactivity and stage,grade,angiogenic profile and proliferative index in bladder urothelial carcinomas[J]..International Urology and Nephrology,2010(1)
[3]Effect of YC‐1,an NO‐independent,superoxide‐sensitive stimulator of soluble guanylyl cyclase,on smooth muscle responsiveness to nitrovasodilators[J]..British Journal of Pharmacology,2009(4)
[4]Dysregulation of Hypoxia Inducible Factor‐1αin Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Cell Lines Correlates With Invasive Potential[J].Noam A.Cohen;Stephen Y.Lai;Amy F.Ziober;Barry L.Ziober.The Laryngoscope,2009(3)
[5]李杨乐.HIF-1α特异性抑制剂YC-1对缺氧条件下人膀胱癌细胞株T24细胞生物学行为的影响[D].中南大学,2011.