其实两种方法都可获得满意的效果。关键在于染液的配制,如果非要有个比较,那么水溶伊红的染色效果更稳定,容易掌握,分化宽容度的更大一些,但染色效果没有醇溶性伊红鲜艳,而醇溶性伊红,相比之下染色效果不够稳定,不易掌握,且液体挥发较快,不太经济,分化也比较困难,特別是对乙醇的浓度要求很高,越精确分化越好,否则会出现分化不够与分化过度在很短时间内发生的现象,但它染色效果鲜艳,与苏木素对比清晰。
水溶伊红
醇溶伊红
有些病理科采用水溶性伊红经过处理后用乙醇溶解的方法,也可取得较好效果。
方法:将水溶性伊红溶于蒸馏水中,然后加浓盐酸10ml,充分搅拌,静置过夜后过滤。过滤后的沉淀用蒸馏水冲洗二次,再过滤;将沉淀物连同滤纸一起放入温箱内干燥,加95%乙酵1000ml,配成饱和液。使用前鮮用95%的乙醇1:1~2倍稀释,加人1%~2%冰醋酸。
据说用此法配制的醉溶性伊红染色液使用期长,染色速度快。结合正确的染色方法时,切片分化不易脱色,颜色清晰艳丽,与蓝色的细胞核对比突出,且长期保存也不易褪色。何实际应用中,这样配制的醇溶性伊红染色液普遍使用期短、难染色、易褪色等现象,一般认为,此种现象一般由以下几种原因引起的:
1.溶剂种类:醇溶性伊红几乎不溶于水和低浓度乙醉:如用纯乙酵取代95%乙醇配制染液,也会影响伊红溶解度,且染色后切片经低浓度乙醇分化易脱色。
2.染色液浓度:室温下醇溶性伊红在95%乙醇中较难溶解,远低于有关文献记载的溶解度(0.45g/100ml),这可能与染料的生产工艺有关。所以,在室温下直接配制染色液往往达不到目标浓度,切片染色较淡。
3.冰醋酸的量:适量的冰醋酸能使染色液保持比胞质等电点略为酸性的环境(pH比染色体等电点高),从时使胞质电离并带正电,可被带负电的伊红色酸负离子染色。不加或加入少量冰醋酸,伊红仅通过渗透成弥散作用很准染色,而且和组织结合不牢固,分化后易脱色。加入过量冰醋酸,一方面使染色体也发生电离带正电,造成核、质对比不清;另一方面抑制了伊红电离,形成酵溶性伊红沉淀,导致染色液失效。
4.染色前后处理:苏木精染核后,切片未采用流水冲洗蓝化,残存的酸或碱性物质易引起伊红褪色;或者水洗蓝化后,切片直接进入醇溶性伊红染色液,因短时间内乙醇难以置换出组织内水分,引起染色不均匀,并且水分被频繁带入染色液会使乙醇浓度下降.伊红溶解度也随之降低并出现沉淀,染色液失效;再者伊红染色后,切片先用流水冲洗再入乙醇分化,则和组织尚未极性吸附的色酸负离子因乙醇入水的张力而脱去,结果切片染色较淡。鉴于上述原因,对醇溶性伊红的染液配制与染色方法给出以下建议:
5.不用蒸溜水或纯乙醇溶解伊红,以95%乙醇为标准溶剂配制储备液和染色液。
(1)以饱和储备液作为浓度标准。为确保储备液完全饱和,可采用恒温温水浴箱或数控裱片机等水浴加热设备,禁用电炉、微波炉对乙醉直接加热,以免发生意外。
(2)配制染色液时,切勿搅拌或振荡有沉淀的储备液,取其1份按1:1或1:2加入95%乙醇,冰醋酸以1~2滴/100ml为好。
(3)切片蓝化采用流水冲洗,此对于盐酸乙酵分化或弱碱溶液促蓝者尤为重要。
(4)切片浸染伊红前,必须先人95%乙醇处理,染色后,直接入85%乙醇分化。
(5)对已经产生沉淀的染色液,尽置弃之不用。