背景[1-3]
U-2OS]人骨肉瘤细胞源自一名15岁女孩的胫骨中等分化的肉瘤中分离建立的。该细胞表达胰岛素样生长因子Ⅰ、Ⅱ（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）受体和骨肉瘤衍生生长因子（ODGF）。
U-2OS]人骨肉瘤细胞
U-2OS]人骨肉瘤细胞培养操作
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
U-2OS]人骨肉瘤细胞可以用于人骨肉瘤细胞U2OS靶向肽的筛选、鉴定及初步应用研究
利用噬菌体展示技术筛选并鉴定对人骨肉瘤U2OS细胞具有高度亲和力和特异性的多肽,进一步将靶向多肽与金纳米笼偶联,评价多肽靶向热疗骨肉瘤细胞的能力(图1),为进一步开发人骨肉瘤的靶向治疗提供基础。
方法:1.以U2OS作为靶细胞,人成骨细胞hFOB1.19为阴性消减细胞,对Ph.D.-12噬菌体展示文库进行全细胞差减筛选。首先将噬菌体文库与hFOB1.19细胞充分结合,排除与hFOB1.19结合,即非特异性结合靶细胞的部分噬菌体,将剩下的文库与U2OS充分结合,洗涤后去除特异性与亲和力较低的噬菌体,通过洗脱及酸化裂解得到对U2OS具有较高特异性和亲和力的噬菌体(包括"细胞表面结合噬菌体"及"内化噬菌体"),将这一轮得到的肽库投入下一轮的筛选,经过四轮重复筛选提高筛选的精确性;
2. 将每一轮得到的噬菌体涂板进行蓝斑计数,随后从计数平板中随机挑选分离良好的单克隆噬菌体,扩增后送测序公司进行序列测定,获得各噬菌体外源多肽的DNA序列;
3. 将上述重复率>1的单克隆噬菌体扩增、纯化,再分别投入筛选(方法同步骤1,"单克隆噬菌体"代替"噬菌体文库")进行反向鉴定;
4. 挑选重复率较高的单克隆噬菌体,以hFOB1.19、人骨肉瘤细胞MG-63及人乳腺癌细胞MCF-7为对照细胞进行ELISA检测、免疫组织化学染色鉴定其对靶细胞的亲和力及特异性;
5. 挑选与U2OS特异性及亲和力最高的单克隆噬菌体为目标噬菌体,依据其DNA序列合成目标多肽和FITC标记的目标多肽;
6. 梯度单位FITC荧光标记的目标多肽分别与靶细胞、hFOB1.19、MG-63及MCF-7结合,通过流式细胞仪检测荧光值鉴定目标多肽对靶细胞的亲和力及特异性;
7. 靶细胞U2OS与梯度目标噬菌体孵育后,与定量FITC标记的目标多肽孵育,流式细胞仪检测平均荧光强度;U2OS与梯度目标多肽孵育,然后与目标噬菌体孵育,随后涂板进行蓝斑计数,综合以上结果验证目标噬菌体与其外源多肽竞争性结合U2OS;
8.将目标多肽与金纳米笼(Goldnanocages,GNCs)偶联形成多肽-金纳米笼偶联物(Peptide-GNCs,P-GNCs),以hF0B1.19为对照细胞,与U2OS充分培养后,808nm近红外激光照射,记录照射前后细胞培养液温度变化,CCK-8法检测细胞增殖、钙黄绿素染色检测细胞死亡情况。
参考文献
[1]Prognostic factors for survival in patients with high-grade osteosarcoma using the Surveillance,Epidemiology,and End Results(SEER)Program database[J].Kyle R.Duchman;;Yubo Gao;;Benjamin J.Miller.Cancer Epidemiology,2015(4)
[2]Facile preparation of gold nanocages and hollow gold nanospheres via solvent thermal treatment and their surface plasmon resonance and photothermal properties[J].Haifei Wang;;Jing Han;;Wensheng Lu;;Jianping Zhang;;Jinru Li;;Long Jiang.Journal of Colloid And Interface Science,2015
[3]Subtype-specific binding peptides enhance the therapeutic efficacy of nanomedicine in the treatment of ovarian cancer[J].Yao-An Shen;;Chang-Sheng Liu;;Yen-Hou Chang;;Po-Hung Chen;;Chun-Lin He;;Han-Chung Wu;;Chi-Mu Chuang.Cancer Letters,2015(1)
[4]Comparative effect of gold nanorods and nanocages for prostate tumor hyperthermia[J].Ryan Robinson;;Wiebke Gerlach;;Hamidreza Ghandehari.Journal of Controlled Release,2015
[5]杨轩.人骨肉瘤细胞U2OS靶向肽的筛选、鉴定及初步应用研究[D].广州中医药大学,2017.