背景[1-3]
人胎盘绒毛癌细胞是一株超三倍体人类细胞株。人胎盘绒毛癌细胞的典型染色体数为71，发生率为34%，多倍体率为2.6%。t(4;11)(p15;q13)，i(13q)，t(10p15q)，del(18)(q21)和6个其他标记在大多数细胞中常见，另有两个标记在一些细胞中可见，在一个N14和两个N22中可见大卫星。N2、N5和N9有4个拷贝，而N7、N13、N18、N21和X为单拷贝，Q-带检测法可以检测到单个Y染色体。
人胎盘绒毛癌细胞
人胎盘绒毛癌细胞培养操作规程
一、人胎盘绒毛癌细胞培养基及培养冻存条件准备：
准备RPMI-1640培养基，90%；优质胎牛血清，10%。
培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二、人胎盘绒毛癌细胞处理：
1）复苏人胎盘绒毛癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）人胎盘绒毛癌细胞传代：如果人胎盘绒毛癌细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人胎盘绒毛癌细胞1-2次。
加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化2-3分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。
轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1200RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。
移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
应用[4][5]
人胎盘绒毛癌细胞可以用于米非司酮对人早孕胎盘绒毛的影响
目的:1.研究米非司酮对人胎盘绒毛癌细胞血管生成因子的影响,探讨其与绒毛间质血管形成的可能关系;
2.研究米非司酮对体内人早孕绒毛滋养细胞增殖与凋亡的影响;
3.探讨米非司酮对体外培养的绒癌细胞系BeWo、JEG-3的凋亡作用。
方法:1.应用免疫组织化学技术标记早孕人流组和米非司酮药流组绒毛组织中CD34,并行血管体视学观察;
2.应用免疫组织化学方法检测早孕人流组和米非司酮药流组绒毛组织中VEGFAb7、VEGF JH121、Ang-1和TSP蛋白的表达,并进行图像分析;
3.免疫组化与TUNEL技术,检测滋养层细胞增殖与凋亡指数;免疫组化与图像分析法,检测Caspase-3在人早孕绒毛滋养层的表达强度;Western blotting技术检测绒毛组织中凋亡下游和上游蛋白Caspase-3、-7和Caspase-9的表达;
4.体外培养绒癌细胞系BeWo和JEG-3,分别以不同浓度米非司酮0、0.25、1、2.5、10、25μmol/L对两细胞系进行干预,分为对照组和米非司酮处理组。通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡和坏死细胞比率;
5.采用透射电子显微镜技术观察早孕人流组与米非司酮药流组绒毛组织的超微结构特征。
结果:1.米非司酮对人早孕绒毛间质血管影响的体视学观察米非司酮药流组微血管长度密度(LV)较人流组降低(P=0.032,P＜0.05);微血管体积密度(VV)显著降低(P=0.002,P＜0.01)。
2.米非司酮对早孕绒毛滋养层血管生成因子分泌的影响早孕人流组绒毛滋养层细胞VEGF Ab-7和Ang-1的表达强度高于米非司酮药流组,差异有统计学意义(P＜0.05);而VEGF JH121和TSP在药流组早孕绒毛滋养层细胞的表达强度高于人流组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。各类血管生成因子分别与绒毛间质微血管LL和VV作相关性分析,VEGFAb-7和Ang-1与血管新生成正相关(P＜0.05),而VEGF JH121和TSP与血管新生负相关(P＜0.05)。
3.米非司酮对绒毛滋养层细胞增殖与凋亡的影响早孕人流组与米非司酮药流组均有Ki67和TUNEL阳性表达,前者主要定位于细胞滋养细胞,后者主要在合体滋养细胞表达。采用“单位面积阳性核数”来评价增殖与凋亡状况,经图像分析,米非司酮作用后,绒毛滋养层细胞增殖能力降低,凋亡增多,差异具有统计学意义(P＜0.05)。
4.米非司酮对凋亡上、下游凋亡蛋白Caspase的影响采用免疫组化检测两组绒毛滋养层细胞Caspase-3的表达,结果经图像分析定量处理,在米非司酮药流组的表达强度显著高于早孕人流组,差异具有统计学意义(P＜0.01)。利用Western blotting技术检测早孕人流组(n=8)和药物流产组(n=8)绒毛组织中凋亡下游蛋白Caspase-3,-7和凋亡上游蛋白Caspase-9表达。16例标本均检测到Caspase-3,它在药流组表达高于早孕人流组。Caspase-7在药流组的检出率(75%)高于早孕人流组(37.5%),Caspase-9在药流组的检出率(50%)亦高于早孕人流组(12.5%),可见Caspase-7和Caspase-9在药流组表达均较早孕人流组强。
参考文献
[1]Functional significance of VEGF-a in human ovarian carcinoma:Role in vasculogenic mimicry[J].Jun-yan Wang;;Tao Sun;;Xiu-lan Zhao;;Shi-wu Zhang;;Qiang Gu;;Xing-hui Wang;;Nan Zhao;;Shuo Qie;;Bao-cun Sun.Cancer Biology&Therapy,2008(5)
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[3]Vasculogenesis and angiogenesis in the early human placenta[J].Ramazan Demir;;Yasemin Seval;;Berthold Huppertz.Acta Histochemica,2007(4)
[4]Hypoxic Switch in Mitochondrial Myeloid Cell Leukemia Factor-1/Mtd Apoptotic Rheostat Contributes to Human Trophoblast Cell Death in Preeclampsia[J].Nima Soleymanlou;;Andrea Jurisicova;;Yuanhong Wu;;Mari Chijiiwa;;Jocelyn E.Ray;;Jacqui Detmar;;Tullia Todros;;Stacy Zamudio;;Martin Post;;Isabella Caniggia.The American Journal of Pathology,2007(2)
[5]楼湘莹.米非司酮对人早孕胎盘绒毛的影响[D].暨南大学,2008.