背景[1-3]
人咽鳞癌细胞是1968年从一位印度下咽骨肿瘤患者的钻孔活组织切片中建立了FaDu细胞株。在建立的细胞株中发现细胞质中含有成束的细丝,并且细胞分界上的桥粒特别突出。
人咽鳞癌细胞
人咽鳞癌细胞操作流程:
1、收到人咽鳞癌细胞后,请按照以下方法进行操作:
取出25cm2培养瓶,75%酒精擦拭培养瓶,拆下封口膜,放入37℃,5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态,然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。
2、人咽鳞癌细胞传代:
1)人咽鳞癌细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时,弃25cm2培养瓶中的培养液,用PBS清洗细胞一次;
2)添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中,倒置显微镜下观察,待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化,再轻轻吹打细胞使之脱落,然后将悬液转移至15ml离心管中,1000rpm离心5min;
3)弃上清,沉淀细胞用12ml完全培养基重悬,然后按1:2比例进行分瓶传代,最后放入37℃,5%CO2细胞培养箱中培养;
4)待细胞完全贴壁后,观察培养结果,之后进行换液培养或传代。
3、人咽鳞癌细胞冻存:
1)人咽鳞癌细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时,弃25cm2培养瓶中的培养液,用PBS清洗细胞一次;
2)添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中,倒置显微镜下观察,待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化,轻轻吹打细胞使之脱落,然后将悬液转移至15ml离心管中,1000rpm离心5min;
3)用适量的冻存液(FBS:DMSO=9:1)重悬细胞,并放置于冻存管中;
4)先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h,然后将其移入-80℃过夜,24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。
4、人咽鳞癌细胞复苏:
1)从液氮中取出细胞冻存管(注意:佩戴防爆管面具),快速将其置入37℃水浴中解冻,直至冻存管中无结晶,然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁;
2)将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中,1000rpm离心5min;
3)弃上清,沉淀用5ml完全培养基重悬,接种25cm2培养瓶,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养;
4)第二天,换用新鲜完全培养基继续培养。
应用[4][5]
人咽鳞癌细胞可以用于外泌体运载的TRPP2 siRNA抑制咽鳞癌细胞的上皮—间质转变
近年来放疗、化疗、免疫治疗以及外科手术已广泛应用于头颈癌的临床治疗中,但由于癌细胞容易转移,头颈部恶性肿瘤的治疗效果仍不理想。其中,上皮-间质转变是肿瘤细胞转移过程中的重要一环。TRPP2(瞬时电位通道)信号通路已经被证明可以通过调节喉鳞状细胞癌的EMT(上皮-间质转变)过程来增强癌细胞的侵袭与迁移。这一发现为肿瘤的临床治疗提供了新的思路。
探讨外泌体/TRPP2 siRNA复合物是否可以通过抑制TRPP2表达来影响FaDu(人咽鳞癌细胞)细胞的上皮-间质转变过程。
方法1.外泌体与TRPP2 siRNA结合使用外泌体提取液和高速离心的方法提取人胚肾293细胞(HEK-293)外泌体,用琼脂凝胶电泳法检测TRPP2 siRNA与外泌体是否稳定结合。
2. 观察外泌体/TRPP2 siRNA复合物在FaDu细胞中的分布使用荧光显微镜观察被荧光染料标记的外泌体及TRPP2 siRNA,以确定外泌体/TRPP2 siRNA复合物是否被FaDu细胞摄取。
3. 检测TRPP2、vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白在被外泌体/TRPP2siRNA复合物转染后的FaDu细胞中的表达使用Western blotting的方法检测TRPP2,vimentin,N-cadherin和E-cadherin蛋白的表达水平,以确定转染后的FaDu细胞的TPRR2通道及EMT过程是否受到影响。
结果1.外泌体能与TPRR2 siRNA稳定结合。
2. 外泌体/TRPP2 siRNA复合物能被FaDu细胞大量摄取。
3.外泌体/TRPP2 siRNA复合物能使转染的FaDu细胞EMT过程减弱。结论外泌体/TRPP2 siRNA复合物可以被FaDu细胞摄取并显著影响其TRPP2表达和EMT过程,外泌体/TRPP2 siRNA复合物有望成为头颈肿瘤治疗的新的方向。
参考文献
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[5]王春晖.外泌体运载的TRPP2 siRNA抑制咽鳞癌细胞的上皮—间质转变[D].安徽医科大学,2018.