背景[1-3]
人脐静脉融合细胞是在PEG胁迫下，将原代培养的人脐静脉细胞与抗硫鸟嘌呤的A549克隆株融合，构建了人脐静脉细胞株,EA.HY926。融合子在HAT培养基上生长并以八因子相关抗原筛选。EA.HY926已经过100次以上的群体倍增(PDLs)。电镜照片显示Weibel-Palade小体的细胞质分布以及组织特异性的细胞器，分化的内皮细胞特性如血管生成，体内平衡/血栓形成，血压及炎症反应。
人脐静脉融合细胞
人脐静脉融合细胞在DMEM(含1.5g/LNaHCO3)培养基中生长良好，大部分品牌的DMEM含有较高浓度的NaHCO3（3.7g/L），若使用DMEM（3.7g/L NaHCO3）培养基培养细胞时需要提高CO2浓度（7%-10%）。
人脐静脉融合细胞复苏、传代及冻存流程参考：
1、人脐静脉融合细胞复苏
1）配制人脐静脉融合细胞完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；
2）人脐静脉融合细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）吸弃上清，得到人脐静脉融合细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；
4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。
2、人脐静脉融合细胞传代
1）待人脐静脉融合细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；
2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；
3）收集人脐静脉融合细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。
3、人脐静脉融合细胞冻存
1）按照人脐静脉融合细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；
2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。
3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。
应用[4][5]
人脐静脉融合细胞可以用于丹参饮中四种酚性成分对棕榈酸钠刺激的人脐静脉细胞融合细胞表达ICAM-1的影响
1. 建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定丹参饮中四种酚性成分丹参素(DSS)、原儿茶酸(PCC)、原儿茶醛(PCL)和丹酚酸B(Sal B)的含量。
2. 研究这四种酚性成分对棕榈酸钠(SPA)刺激的人脐静脉细胞融合细胞(EA.hy926)表达细胞间黏附分子(ICAM-1)的影响及其作用机制。
方法:1.建立HPLC法测定丹参饮中四种酚性成分的含量:采用Genmini5μm C18 110A(250×4.60mm,5μm)色谱柱,以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)溶液为流动相,梯度洗脱(07min,2%A→10%A;720min,10%A→23%A;2035min,23%A→27%A;3538min,27%A→38%A;3842min,38%A;4243min,38%A→2%A;4356min,2%A),流速0.8ml/min,柱温为25℃,检测波长288nm,进样量15μl。然后进行方法学验证,最后测定丹参饮中四种酚性成分的含量。
3. 四种酚性成分对SPA诱导EA.hy926表达ICAM-1的影响。设置对照组、模型组、受试药组、阳性对照药组。对照组以牛血清蛋白(BSA)处理(不用SPA刺激),模型组和受试药组用SPA刺激,同时受试药组给予四种酚性成分的高、中、低三个剂量,阳性药对照组以普罗布考(Pro)处理,各组均处理24h。
(1) 分别采用噻唑蓝法(MTT法)、流式细胞术(FCM)和油红染色法研究SPA和四种酚性成分对EA.hy926的生存率、凋亡和形成泡沫细胞的影响。
(2) 采用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印迹法(WB)研究SPA刺激EA.hy926表达ICAM-1蛋白的量效和时效关系。
(3) 采用ELISA和WB法研究四种酚性成分对SPA刺激EA.hy926表达ICAM-1蛋白的影响。3.SPA诱导EA.hy926表达ICAM-1的机制研究。设置对照组、模型组、TLR2和TLR4激动剂(脂多糖(LPS))组、TLR4抑制剂(TAK-242)组和MyD88抑制剂(ST2825)组。对照组以BSA处理,模型组、激动剂组和抑制剂组用SPA刺激,同时激动剂组和抑制剂组给予高、中、低三个剂量的LPS、TAK-242和ST2825,各组均处理24h。
(1) 采用MTT法研究LPS、TAK-242和ST2825对EA.hy926生存率的影响。
(2) 采用ELISA和WB法研究LPS、TAK-242和ST2825对SPA刺激EA.hy926表达ICAM-1的影响。
结果:1.在40min内,丹参饮中DSS、PCC、PCL、Sal B四种酚性成分能够实现完全分离,并且浓度与峰面积在一定范围内线性关系良好,相关系数r≥0.9998。
2. 随着浓度和作用时间的增加,SPA降低EA.hy926生存率、促进EA.hy926凋亡和促进EA.hy926形成泡沫细胞的作用显著增强。四种酚性成分能够提高EA.hy926生存率,降低SPA刺激EA.hy926形成泡沫细胞的作用。DSS和Sal B降低SPA诱导的EA.hy926凋亡。随着浓度和作用时间的增加,SPA促进EA.hy926表达ICAM-1的作用增强。四种酚性成分能够明显降低SPA刺激组ICAM-1、P65、MyD88、TLR1、TLR2、TLR4、TLR6的表达。
3.与SPA刺激组相比,LPS促进了ICAM-1、P65、MyD88、TLR2、TLR4的表达,TAK-242抑制ICAM-1、P65、MyD88、TLR4的表达,ST2825抑制ICAM-1、P65、MyD88的表达。
参考文献
[1]Innate signaling in the inflammatory immune disorders[J].Cheng Qian;;Juan Liu;;Xuetao Cao.Cytokine and Growth Factor Reviews,2014(6)
[2]Shikonin inhibits oxidized LDL-induced monocyte adhesion by suppressing NFκB activation via up-regulation of PI3K/Akt/Nrf2-dependent antioxidation in EA.hy926 endothelial cells[J].Chin-Shiu Huang;;Ai-Hsuan Lin;;Ting-Chun Yang;;Kai-Li Liu;;Haw-Wen Chen;;Chong-Kuei Lii.Biochemical Pharmacology,2014
[3]Brazilin Ameliorates High Glucose-Induced Vascular Inflammation via Inhibiting ROS and CAMs Production in Human Umbilical Vein Endothelial Cells[J].Thanasekaran Jayakumar;;Chao-Chien Chang;;Shoei-Loong Lin;;Yung-Kai Huang;;Chien-Ming Hu;;Antoinet Ramola Elizebeth;;Shih-Chang Lin;;Cheuk-sing Choy;;Joen-Rong Sheu.BioMed Research International,2014
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[5]谢名君.丹参饮中四种酚性成分对棕榈酸钠刺激的人脐静脉细胞融合细胞表达ICAM-1的影响[D].深圳大学,2017.