背景[1-3]
A673是一株源自15岁女性的横纹肌肉瘤的细胞株。A-673细胞在软琼脂上可形成克隆，亦能在免疫抑制血清处理的小鼠中成瘤。A-673细胞有四个以上的标志染色体，一个额外的F染色体和两个异常的B染色体。
A673
A673细胞培养步骤：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备MEM培养基；北美胎牛血清，10%；PS 1%。
2）A673细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）A673细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．A673细胞处理：
1）复苏A673细胞：将含有1mL人胚肺成纤维细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查A673细胞密度。
2）A673细胞传代：如果A673细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于人A673细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗A673细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2ml完全培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。
4.将A673细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）A673细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面以T25瓶为例；
1．A673细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮A673细胞，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
A673可以用于KDSR调控鞘脂代谢与未折叠蛋白反应参与白血病发生发展的研究验证KDSR在白血病中的重要作用,探讨其参与白血病发生发展的可能机制。
【方法】1、应用CRISPR/Cas9文库筛选技术在MOLM13和MV4-11细胞中鉴定参与白血病细胞生存的重要鞘脂酶;
2、通过在8种不同癌症细胞中进行生存竞争实验验证鞘脂酶KDSR在白血病中的重要性;
3、通过流式细胞仪检测MOLM13和MV4-11中敲除KDSR基因后细胞凋亡及周期,细胞染色及电镜检测细胞的分化及内质网变化;
4、应用质谱分析检测KDSR敲除后主要鞘脂改变情况;
5、RNA-seq分析KDSR影响白血病细胞的可能信号通路,并通过蛋白印迹法(Western blot,WB)进行验证;
6、通过透射电子显微镜检测KDSR敲除后,增加鞘脂或内质网应激药物处理后细胞内质网的形态变化;
7、通过流式细胞仪检测检测在不同癌症细胞汇总增加相应鞘脂或内质网应激药物处理后对细胞生存率的改变情况;
8、通过流式细胞仪检测不同癌症细胞在敲除KDSR基因,增加鞘脂,以及内质网应激相关药物治疗后细胞的生存比率,分析其在白血病细胞与其他癌症细胞中的差异;
9、应用流式细胞仪检测不同癌症细胞中内质网应激药物与KDS双处理后白血病细胞与其他癌症细胞的生存差异。
【结果】1、在白血病细胞株MOLM13和MV4-11细胞中,通过对29个鞘脂酶基因进行CRISPR/Cas9文库筛选发现KDSR基因对白血病细胞生存最重要,生存竞争实验验证了敲除KDSR后白血病细胞MOLM13,MV4-11,Jurkat和Hut78细胞活性明显降低,而其他细胞293T,U251,SW620以及A673在KDSR敲除后细胞活性无明显变化;
2、在MOLM13和MV4-11细胞中将KDSR敲除后,Annexin V和活性Caspase3检测均表明细胞凋亡明显增加,Ed U检测显示S期细胞明显减少,有明显统计学意义,提示细胞阻滞在G1/S期;
3、细胞形态学及内质网形态检测发现内质网从长条状变成圆形,但分化不受影响;
4、MOLM13和MV4-11细胞敲除KDSR后3-脱氢鞘氨酸(3-ketodihydrosphingosin,KDS)明显增加,鞘脂从头合成途径的其他鞘脂比如二氢鞘氨醇(Dihydrospingosin,DHS),二氢神经酰胺(Dihydroceramide,DHCer)以及神经酰胺(Ceramide,Cer)均有不同程度的增加,但无明显统计学意义,相反,参与补救合成途径的部分鞘脂例如糖化神经酰胺(Glycoceramide,Gly Cer)和鞘磷脂(Sphingomyelin)则相对下降,没有统计学意义。
参考文献
[1]A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain size determinant.[J].Esk Christopher;Lindenhofer Dominik;Haendeler Simon;Wester Roelof A;Pflug Florian;Schroeder Benoit;Bagley Joshua A;Elling Ulrich;Zuber Johannes;von Haeseler Arndt;Knoblich Jürgen A.Science(New York,N.Y.),2020(6519)
[2]Notch3 contributes to T-cell leukemia growth via regulation of the unfolded protein response.[J]..Oncogenesis,2020(10)
[3]The role of sphingolipids in endoplasmic reticulum stress.[J].Park Woo-Jae;;Park Joo-Won.FEBS letters,2020
[4]Overexpression of PSAT1 promotes metastasis of lung adenocarcinoma by suppressing the IRF1-IFNγaxis.[J].Chan Yung-Chieh;;Chang Yu-Chan;;Chuang Hsiang-Hao;;Yang Yi-Chieh;;Lin Yuan-Feng;;Huang Ming-Shyan;;Hsiao Michael;;Yang Chih-Jen;;Hua Kuo-Tai.Oncogene,2020(12)
[5]刘樵.KDSR调控鞘脂代谢与未折叠蛋白反应参与白血病发生发展的研究[D].福建医科大学,2021.