背景[1-3]
SK-N-SH细胞系由J.L.Bieder建系，它与SK-N-MC所不同的是倍增时间较长且多巴胺-β-羟基酶水平较高。SK-N-SH在细胞介导的细胞毒性试验中用作靶细胞系。
SK-N-SH
SK-N-SH细胞培养操作
1）复苏SK-N-SH细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）SK-N-SH细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）SK-N-SH细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.SK-N-SH细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
SK-N-SH可以用于Sirt-1在氧化应激绣导SK-N-SH细胞凋亡中的作用及其机制研究
确定Sirt-1可能通过其脱乙酰反应调节p53,清除氧化应激诱导的ROS,证明Sirt-1和氧化诱导的ROS在AD及相关疾病进展中的重要性。
方法：以人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH细胞为研究对象,经由Sirt-1基因沉默/过表达处理,同时设立对照,比较各组Sirt-1表达差异,进而分析Sirt-1对神经细胞SK-N-SH的周期进程、增殖、凋亡的影响,探索其可能的机制。通过RT-PCR、Western blotting、荧光素酶报告实验、软琼脂集落形成实验、EDU染色等实验方法,明确Sirt-1及p53之间的关系,p53改变是否可以改变下游基因的表达,分析这种改变,对SK-N-SH细胞的生长和细胞周期进程的影响。
进一步证实Sirt-1是否通过调控p53影响细胞增殖,选用SK-N-AS(p53缺失)细胞,分析Sirt-1能否影响SK-N-AS细胞增殖,进一步明确Sirt-1及p53在细胞的生长和细胞周期进程中的关键作用。
将200μM H2O2(过氧化氢),用于本实验,诱导细胞产生氧化应激(OS),分析、探索氧化应激,是否会抑制p53的转录活性,促使Sirt-1在SK-N-SH细胞中过表达。探索Sirt-1过表达,对细胞凋亡(氧化应激诱导的)的抑制作用及机制。结果Sirt-1基因沉默,能够引起SK-N-SH细胞,G1/G0期的细胞数量,明显下降,S期细胞数量上升,可以观察到G2/M期阻滞,同Scrambled组(对照组)比较,差异具有显著意义(P<0.05);相反,Sirt-1基因过表达可以导致SK-N-SH细胞G1/G0期细胞显著增加。
EdU结果显示,与Scrambled组相比,Sirt-1基因沉默(shSirt-1组)EdU阳性细胞数明显减少,差异具有显著意义(P<0.05),细胞增殖受抑制;而Sirt-1基因过表达可以使SK-N-SH细胞EdU阳性细胞数明显增加,进一步证实Sirt-1参与了SK-N-SH细胞增殖整个进程,具有显著的作用。在Western blotting实验中,各组数据结果提示,在SK-N-SH细胞中,p53、FOXO1蛋白含量,既不受Sirt-1基因沉默的影响,也不受其过度表达的影响。
双荧光素酶报告显示,Sirt-1基因沉默转染处理后,观察到在细胞中,荧光素酶活性,出现一定的升高的现象(P<0.05)。Sirt-1基因过表达转染,可以削弱SK-N-SH细胞的荧光素酶活性。使用30μM pifithrin-α(p53特异性抑制剂)处理后,荧光素酶活性明显减弱,表明Sirt-1是p53转录活性的负调控因子RT-qPCR结果显示,Sirt-1基因沉默可以导致细胞p21 mRNA水平明显升高(P<0.05),而p53、Bax、Bcl-2 mRNA水平无明显差异,表明Sirt-1可以选择性抑制SK-N-SH细胞p53-p21通路,p53与p21的结合活性升高,表明Sirt-1能够抑制p53与p21启动子的结合。
用EX527(Sirt-1抑制剂)处理细胞,Western blotting检测结果提示,Sirt-1的表达对p53的蛋白表达没有影响,但是可以显著抑制p53在K382位点的去乙酰化作用。Sirt-1能够去启动p53乙酰化进程,削弱p53转录活性,细胞周期进程,继而被调节。同SK-N-SH细胞的实验结果相比,Sirt-1修饰对SK-N-AS细胞增殖没有明显影响(P>0.05)。综上,Sirt-1主要通过p53的存在影响细胞增殖和细胞周期的分布。Sirt-1基因沉默转染大大降低了Sirt-1的表达,使细胞穿膜数和迁移数明显减少,从而显著削弱了SK-N-SH细胞的侵袭和迁移。
相反,Sirt-1基因过表达转染,能够引起Sirt-1蛋白,表达水平升高,进而,明显促进SK-N-SH细胞,发生侵袭、迁移。SK-N-SH细胞经过Sirt-1基因过表达/沉默转染后,加入200μM H2O2(过氧化氢),用来触发氧化应激(OS)反应,结果显示,Sirt-1过表达时,SK-N-SH细胞中,H2O2诱导产生的ROS,出现被清除现象。添加10 mM EX527后,SK-N-SH细胞ROS水平显著升高,表明Sirt-1的去乙酰化活性对于其ROS抑制活性至关重要。
Western blotting结果显示,H2O2处理可以明显增加Sirt-1蛋白水平,而对p53蛋白水平无影响,但却能够降低p53的转录活性。加入EX527后,H2O2导致的p53的低转录活性被显著抑制。
参考文献
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[5]刘雷.Sirt-1在氧化应激绣导SK-N-SH细胞凋亡中的作用及其机制研究[D].苏州大学,2021.