背景[1-3]
常规考马斯亮蓝染色试剂盒采用了最经典的考马斯亮蓝R250染色和脱色斱法，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
常规考马斯亮蓝染色试剂盒中的染色液和脱色液经过改良，丌含有毒的甲醇，含有刺激性气味的乙酸。采用常规染色脱色斱法累计时间达到2～3h后可以观察到蛋白条带，采用快速染色脱色斱法20min左右即可观察到蛋白条带。如果想观察到更清晰的蛋白条带则需延长染色、脱色时间。
常规考马斯亮蓝染色试剂盒
常规考马斯亮蓝染色试剂盒操作步骤：
(一)常规考马斯亮蓝染色试剂盒常规染色脱色方法
1、PAGE电泳后取凝胶放入适量Commassie Blue Stain中，确保染色液充分覆盖凝胶。
2、置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1h或更长时间。具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看丌清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2～4h或更长时间丌会对最终的染色效果产生负面影响。
3、倒出染色液，该染色液可以回收重复使用2～3次。
4、加入适量Commassie Blue脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。
5、置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4～24h。期间更换脱色液2～4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1～2h后即可出现。脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。
6、完成脱色后把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油水溶液中，长期保存可以制备干胶。
(二)常规考马斯亮蓝染色试剂盒快速染色脱色方法
1、PAGE电泳结束后取胶放入Commassie Blue stain中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时丌易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。
2、随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5～10min。
3、倒出染色液，染色液可以回收重复使用2～3次。
4、加入适量Commassie Blue脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。
5、微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。
6、随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5～10min。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。
7、更换新鲜的脱色液，重复步骤5和步骤6，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。
8、完成脱色后，把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。
如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油水溶液中，长期保存可以制备干胶。
应用[4][5]
常规考马斯亮蓝染色试剂盒可以用于蛋白印迹考马斯亮蓝显色水凝胶对目标分子的特异性识别
一直以来,蛋白质都是生物体生命活动的核心物质,在生物体内扮演着催化、运输、免疫调节等角色。也正因此,蛋白质的分离与检测越来越受人关注。传统单一的蛋白质检测手段由于其特异性差、操作繁琐等局限性的存在,促使越来越多的科研工作者投入到蛋白质检测领域中。
考马斯亮蓝蛋白质检测法由于其检测速度快等优点而备受关注,但色素与蛋白质作用时所缺少的特异性作用是该方法的不足之处。而常用蛋白质检测手段中,具有良好特异性的免疫印迹法又由于抗体的制备与保存问题导致成本过高、推广困难。源于生物免疫作用的分子印迹技术能够制备出名为分子印迹聚合物的抗体类似物,利用该技术制备聚合物具有操作简便、材料易保存等优点。该技术的出现能够很好的解决免疫印迹法的不足之处。因此,为了将两种技术结合起来,本文研究了考马斯亮蓝与蛋白质的作用机理,并用于指导考马斯亮蓝蛋白检测法与分子印迹技术的联用,制备出分子印迹显色水凝胶。
首先,我们研究了pH对考马斯亮蓝溶液颜色、吸收峰及其与蛋白质作用的影响。通过改变考马斯亮蓝与蛋白质的浓度,考察显色的规律。证明了考马斯亮蓝分子存在的三种形态均能与牛血清白蛋白发生作用,作用后得到的缔合物吸收峰在610 nm附近;过低pH会影响双质子化阳离子组分与蛋白质的相互作用;显色pH在0.6效果。
其次,本文对凝胶基材、定量检测手段以及凝胶合成工艺进行考察与分析。聚丙烯酰胺水凝胶透明度好,凝胶内部分子结构不会影响考马斯亮蓝的显色规律;利用光学图像的灰度值对蛋白质浓度的测定具有操作简便,设备简单等优点;在单体浓度为20 w/v%、交联剂占总单体的2 wt%、引发剂用量占单体0.1 mol%条件下所得的凝胶具有的显色效果。最后,我们在的工艺配方下,合成出了印迹聚合物与非印迹聚合物,考察洗脱液对凝胶的洗脱效果差异及两者对蛋白质的特异性识别性能。
结果表明:以5 w/v%十二烷基硫酸钠(SDS)-10 v/v%乙酸(HAc)溶液为洗脱液效果;所得印迹聚合物对模板蛋白具有一定的特异性识别能力。
参考文献
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[2]Measurement of the total protein in serum by biuret method with uncertainty evaluation.Kangle Zheng;;Liqing Wu;;Zhangjing He;;Bin Yang;;Yi Yang.Measurement,2017
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[4]Preparation and properties of a novel macro porous Ni2+-imprinted chitosan foam adsorbents for adsorption of nickel ions from aqueous solution.Na Guo;;Shi-jun Su;;Bing Liao;;Sang-lan Ding;;Wei-yi Sun.Carbohydrate Polymers,2017
[5]李德燊.蛋白印迹考马斯亮蓝显色水凝胶对目标分子的特异性识别[D].福州大学,2018.