背景[1-3]
TRITON X-100细胞裂解液是一种经典的快速裂解细胞组织并获得蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。Triton X-100、NaCl、Tris-HCl等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
作用原理是利用去污剂Triton X-100破坏脂质双分子层，溶解胞质和细胞膜，破坏分子间微弱结合键的大部分蛋白质抗原。其浓度在0.1%～1%时即可满足几乎所有溶解的需求，且可补充等离子浓度的盐及使pH接近中性。丌宜用Bradford法测定由Triton X-100 Lysis Buffer获得样本的蛋白浓度。
TRITON X-100细胞裂解液
TRITON X-100细胞裂解液操作步骤：
(一)TRITON X-100细胞裂解液贴壁培养细胞
1、取Triton X-100 Lysis Buffer室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
2、去培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
3、按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例加入Triton X-100 Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于细胞1～3s内，细胞就会被裂解。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。
4、10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)TRITON X-100细胞裂解液悬浮培养细胞
1、取Triton X-100 Lysis Buffer室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Triton X-100 Lysis Buffer。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)TRITON X-100细胞裂解液组织样本
1、取Triton X-100 Lysis Buffer室温溶解混匀后，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
2、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
4、按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。
5、步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Triton X-100 Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
6、10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
7、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
应用[4][5]
TRITON X-100细胞裂解液可以用于以Triton X-100为代表的非离子表面活性剂的生物降解研究
表面活性剂是一种在低浓度下能够显著降低界面张力的物质。在农业、医药和日化等领域都有着广泛的应用。然而表面活性剂的大量使用会在环境中积累,造成了一系列的生态问题。因此,治理环境中的表面活性剂,维护生态环境的平衡迫在眉睫。
基于此,本研究从某化工厂污水处理车间好氧曝气池的活性污泥中筛选获得了具有非离子表面活性剂Triton X-100降解能力的菌株ISB5。并对该菌株对Triton X-100降解条件进行了考察,继而在完成菌株ISB5的全基因组测序分析后,对降解基因的克隆和表达进行了初步的研究,主要结果如下:ISB5菌株的细胞个体呈杆状或略弯曲的杆状,两端尖锐,无芽孢,无荚膜,菌体大小约1.3-2.1μm×0.38-0.52μm。通过对菌株的16S r DNA进行测序比对和分析,将菌株ISB5鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
经过单因素实验与响应面分析结合的方法对菌株ISB5降解Triton X-100的条件进行了优化。得出的优化降解条件为:培养温度33℃,培养基Triton X-100初始浓度3.46 mg/m L,培养时间26 h,振荡速率150 r/min,装液量100 m L/250 m L三角瓶,接种量1%(V/V),该条件下菌株对Triton X-100的降解率可达96.21±0.4%。菌株ISB5的全基因组测序分析显示:菌株ISB5的全基因组长度为5514450 bp,GC含量为63.36%。全基因组功能基因预测到5623个功能基因(占全长的89.01%)、22条r RNA和75条t RNA、2个CRISPR序列和15个基因岛。
通过菌株ISB5的全基因组序列与数据库进行比对,找到一个基因组中存在一个与Triton X-100降解能力最相关的基因乙基叔丁基醚降解蛋白(SAD 20)。将合成获得的SAD 20基因与E.coli表达载体p ET-28a(+)连接,构建重组质粒p ET-28a-SAD20,并将其转化到感受态细胞E.coli BL21中进行重组蛋白表达。
参考文献
[1]Research progress of surfactant biodegradation.Qi Wu;;Lin Zhao;;Ruirui Song;;Aijin Ma.IOP Conference Series:Earth and Environmental Science,2019
[2]Evolutionary dynamics of CRISPR gene drives.Charleston Noble;Jason Olejarz;Kevin M.Esvelt;George M.Church;Martin A.Nowak.Science Advances,2017
[3]Aerobic biodegradation of amphoteric amine-oxide-based surfactants:Effect of molecular structure,initial surfactant concentration and pH.Francisco Ríos;;Manuela Lechuga;;Mercedes Fernández-Serrano;;Alejandro Fernández-Arteaga.Chemosphere,2017
[4]Diversity of octylphenol polyethoxylate-degrading bacteria:With a special reference to Brevibacterium sp.TX4.Lin Yi Wen;Yang Chia Chin;Tuan Nguyen Ngoc;Huang Shir Ly.International Biodeterioration&Biodegradation,2016
[5]王宝任.以Triton X-100为代表的非离子表面活性剂的生物降解研究[D].辽宁石油化工大学,2021.