背景[1-3]
人胆管癌细胞是从源于肝内胆管树的中分化腺癌患者的恶性腹水细胞中建立的。
人胆管癌细胞接收后的处理：
1）收到细胞后，活细胞首先观察培养瓶是否完好，培养液是否漏液，培养基是否浑浊；冻存细胞是否干冰已挥发完，冻存管盖是否脱落，破碎。
2）人胆管癌细胞处理：
复苏的细胞：如果是T-25培养瓶活细胞，收到后请用75%的酒精对培养瓶表面进行消毒处理，然后转入培养箱中静置2~3h后再进行后续处理。
冻存细胞：如果是干冰运输的冻存细胞，收到后请立即转入液氮存储或者短暂（24h）放置-80度冰箱保存，或者直接进行细胞复苏。
人胆管癌细胞
人胆管癌细胞复苏、传代及冻存流程参考：
1、人胆管癌细胞复苏
1）配制人胆管癌细胞完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；
2）人胆管癌细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；
4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。
2、人胆管癌细胞传代
1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；
2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；
3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。
3、人胆管癌细胞冻存
1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；
2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。
3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。
应用[4][5]
人胆管癌细胞可以用于miR-92a-3p靶向肾母细胞瘤过表达基因调节人胆管癌细胞迁移、侵袭能力的分子机制研究
通过对已发表的胆管癌公共数据集进行生物信息学分析,最终筛选出在m RNA和蛋白水平表达都显著上调的肾母细胞瘤过表达基因(Nephroblastoma overexpressed gene,NOV)并深入分析其功能,进一步设计实验,验证其在胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用以及分子机制的研究。
NOV(又名CCN3)是CCN家族6个成员之一。基于CCN家族在肿瘤生物进程中扮演的重要角色,我们对其家族6个成员在10种泛癌数据集中进行了生物信息学分析,结果表明NOV在不同肿瘤病人中具有差异表达多样性,其中在胆管癌、卵巢癌、胰腺癌中显著上调,在其他7种肿瘤中显著下调。
胆管癌中,NOV是CCN家族6个成员中上调表达最显著的分子。NOV已被证明可以调节多种人类癌症中的多种病理生理过程,但其在胆管癌中的高表达和生物学功能仍然未知。本研究旨在探讨NOV对胆管癌细胞增殖、迁移及侵袭的调控作用。首先我们通过荧光定量PCR(q-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)实验验证NOV在两种CCA细胞HCCC9810(以下简称9810)和RBE中是否和生物信息学预测(NOV在CCA中高表达)一致,然后连接NOV基因于pc DNA3.0载体中使其在9810和RBE细胞中有效过表达,并将该实验分为阴性对照组(pc DNA3.0)和过表达组(NOV);应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术将靶向NOV的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染至9810和RBE细胞中,有效沉默NOV的表达,并将该实验分为阴性对照组(si-NC)和沉默组(si-NOV-1,si-NOV-2)。
依次分别进行如下实验:在9810和RBE细胞中通过q-PCR和Western Blot分别检测细胞中NOV的m RNA和蛋白表达情况;通过CCK-8细胞增殖实验和细胞集落形成实验观察NOV对9810和RBE细胞增殖能力的影响;利用细胞划痕和Transwell小室进行迁移实验来检测NOV对9810和RBE细胞迁移能力的影响;利用Transwell小室微孔膜上室面均匀涂上基质胶进行细胞侵袭实验,以此来观察NOV对9810和RBE细胞侵袭能力的影响;利用Western Blot技术检测细胞中上皮标志物蛋白E-cadherin和间质标志物蛋白Vimentin,N-cadherin,Snail和MMP9的表达水平;利用Western Blot技术探究NOV下游调控分子;利用生物信息学预测以及双荧光素酶报告系统分析,探究micro RNA调控NOV在CCA细胞中的上调机制。
结果显示,NOV在9810和RBE中的表达显著高于正常人胆管上皮细胞HIBEC(P<0.001)。过表达NOV显著促进了9810和RBE细胞的迁移和侵袭,相反的,沉默NOV显著抑制了9810和RBE细胞的迁移和侵袭。但NOV对9810和RBE细胞的增殖无明显影响(P>0.05)。
此外,过表达NOV的9810和RBE细胞中上皮标志物E-cadherin表达显著下调,而间质标志物Vimentin,N-cadherin,Snail,MMP9表达显著上调;相反的,沉默NOV的9810和RBE细胞中上皮标志物E-cadherin表达显著上调,而间质标志物Vimentin,N-cadherin,Snail,MMP9表达显著下调,说明NOV可以促进胆管癌细胞9810和RBE的上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)进程。
参考文献
[1]Treating cancer with microRNA replacement therapy:A literature review.Nayer Hosseinahli;;Mahyar Aghapour;;Pascal H.G.Duijf;;Behzad Baradaran.Journal of Cellular Physiology,2018
[2]Targeting cholangiocarcinoma.Joachim C.Mertens;;Sumera Rizvi;;Gregory J.Gores.BBA-Molecular Basis of Disease,2018
[3]Cholangiocarcinoma.Michela Squadroni;;Luca Tondulli;;Gemma Gatta;;Stefania Mosconi;;Giordano Beretta;;Roberto Labianca.Critical Reviews in Oncology/Hematology,2017
[4]Role of the Notch signaling in cholangiocarcinoma.Cigliano;;Wang;;Chen;;Calvisi.Expert Opinion on Therapeutic Targets,2017
[5]姬丫丫.miR-92a-3p靶向肾母细胞瘤过表达基因调节人胆管癌细胞迁移、侵袭能力的分子机制研究[D].南京师范大学,2020.