背景[1-3]
小鼠浆细胞瘤源自BALB/c小鼠的浆细胞瘤；MPC-11细胞含有A型病毒颗粒，可产生免疫球蛋白、IL-6；MPC-11细胞鼠痘病毒阴性。
小鼠浆细胞瘤
小鼠浆细胞瘤细胞培养操作：
1)复苏小鼠浆细胞瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠浆细胞瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
小鼠浆细胞瘤可以用于卡培他滨对多发性骨髓瘤MPC-11细胞的作用及机制研究
探讨卡培他滨抑制多发性骨髓瘤MPC-11细胞增殖、促进其凋亡及可能的作用的机制。
方法:采用0、80、160、320、640、1280μg/ml浓度的卡培他滨和多发性骨髓瘤MPC-11细胞共培养48h后,用CCK-8法检测MPC-11细胞增殖;Annexin V/PI双染色后流式细胞仪检测细胞凋亡;选择IC50浓度卡培他滨作用组的MPC-11细胞,在共培养48h时,用基因芯片筛选出与对照组有表达差异的miRNAs;RT-PCR进一步验证相关miRNAs的表达;采用灌胃法观察卡培他滨对小鼠MPC-11瘤组织的抑制作用。
结果:1卡培他滨对MPC-11细胞形态的影响不同浓度卡培他滨对MPC-11细胞作用48h后,与正常对照组相比,各组细胞形态均有明显的变化。随着卡培他滨浓度的增加,细胞数量逐渐减少、且碎片逐渐增多。可见细胞皱缩、边缘不清或不规则,细胞间隔明显增大,形态细胞各异。而正常对照组细胞透亮、形态规则、边界清楚、细胞成团分布。
2卡培他滨对MPC-11细胞增殖的影响CCK-8实验表明,卡培他滨能有效抑制MPC-11细胞的增殖,其抑制增殖的作用随着药物浓度的增加而增加,呈剂量依赖关系。
3卡培他滨对MPC-11细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果表明,卡培他滨可促进MPC-11细胞凋亡,且凋亡的时间主要发生在细胞中晚期。经过不同浓度梯度的卡培他滨处理MPC-11细胞48h后,各剂量组(0、80、160、320、640、1280μg/ml)均出现不同程度的凋亡,其总凋亡率分别为4.10±1.43%、20.16±1.86%、21.71±2.49%、28.37±3.74%、43.03±2.67%及95.45±1.45%,且细胞的凋亡比例在早、中、晚各个时期均出现随卡培他滨浓度增加而有增高的趋势,尤以中晚期(各剂量组中晚期凋亡率依次为:1.18±0.60%、13.57±1.12%、14.67±0.67%、20.73±2.90%、34.47±1.16%及92.67±1.17%)为甚。
4卡培他滨对MPC-11细胞miRNAs的影响基因芯片检测发现,卡培他滨可显著地上调或下调MPC-11细胞的多个miRNAs,其中表达上调的miRNAs84个,表达下调的miRNAs24个。表达上调的基因有:let-7i、let-7b、let-7c、mir-29b、mir-15a、mir-148a、mir-574、mir-22等;表达下调的基因有:mir-21、mir-207、mir-3969、mir-669a、mir-669c、mir-467e、mir-712、mir-714等。
5 RT-PCR检测miRNAs的表达量采用RT-PCR法检测miRNAs的表达,对照组mir-15a、mir-29b及mir-21相对表达量分别为0.394±0.069、0.572±0.026及1.002±0.077,而卡培他滨IC50组分别为1.003±0.095、1.002±0.080及0.328±0.047,差异具有统计学意义。与对照组相比,IC50组mir-15a、mir-29b相对表达量增高1.5倍以上,而mir-21相对表达量降低60%以上。
6卡培他滨对多发性骨髓瘤组织的抑制作用对照组瘤重为4.14±0.65g,而卡培他滨组(375mg/kg)瘤重为1.36±0.78g,与对照组相比较,卡培他滨抑制瘤组织生长率达67.5%。
结论:无论是在体外细胞层面、还是整体动物层面,卡培他滨均显示出良好的抗多发性骨髓瘤的作用,且在一定浓度范围内存在量效依赖关系。其作用机制是通过抑制细胞增殖、增加细胞凋亡、影响癌/抑癌基因miRNAs的表达实现的。
参考文献
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[3]Cancer statistics,2015.Rebecca L.Siegel;;Kimberly D.Miller;;Ahmedin Jemal.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2015
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[5]杨芬.卡培他滨对多发性骨髓瘤MPC-11细胞的作用及机制研究[D].华中科技大学,2017.