背景[1-3]
EMT6细胞系小鼠乳腺癌细胞是从可移植的鼠乳腺癌中建立的，该癌在植入增生的乳腺肺泡结节后出现在BALB/cCRGL小鼠中。所得肿瘤系（命名为KHJJ）在BALB/cKa小鼠中繁殖，并在第25次动物传代后适应组织培养，并将该细胞系命名为EMT。EMT6是1971年在斯坦福大学分离的EMT的克隆分离物。
EMT6细胞系小鼠乳腺癌细胞
EMT6细胞系小鼠乳腺癌细胞复苏、传代及冻存流程参考：
1、EMT6细胞系小鼠乳腺癌细胞复苏
1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；
2）细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；
4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。
2、EMT6细胞系小鼠乳腺癌细胞传代
1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；
2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；
3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。
3、EMT6细胞系小鼠乳腺癌细胞冻存
1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；
2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。
3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。
应用[4][5]
EMT6细胞系小鼠乳腺癌细胞可以用于钠钾合金注射式消融方法抗小鼠EMT6乳腺癌细胞移植瘤实验研究
液态碱金属是新兴的热化学微创消融恶性肿瘤手段。本研究尝试采用钠钾合金(Na K合金)注射式消融方法治疗小鼠EMT6乳腺癌细胞移植瘤,探讨该治疗手段治疗肿瘤的可行性,并动态观察评估其治疗的有效性。
方法:1动物采用15只6周龄平均重量20g的BALB/c雌鼠。
2利用固态金属钠和金属钾在常温常压硅油保护下制备液态Na K合金,并保存于硅油中。
3将冻存的EMT6小鼠乳腺癌细胞进行传代培养,收集培养好的肿瘤细胞重悬至2×107/ml,向每只小鼠右后腿腹股沟皮下注射0.2ml细胞悬液。
4接种肿瘤细胞后第10天根据肿瘤生长体积及形状将小鼠分为A、B两个治疗组,即肿瘤完全消融组与部分消融组,每组5只,剩下5只为C组对照组。
5消融治疗台为带有四壁玻璃槽,将热电偶插入肿瘤中心位置以便监测及收集消融过程肿瘤中心温度,利用红外热像仪捕获消融过程小鼠体表热效应的红外图像。
6采用一次性胰岛素注射器将液态Na K合金注入A、B两治疗组小鼠肿瘤内进行热化学消融治疗,C组小鼠不进行治疗。治疗结束后立即在每组中处死1只小鼠取出残留组织或肿瘤制成病理切片。其余小鼠放回笼内连续测量20天肿瘤体积。将小鼠体积数据进行连续测量双因素方差分析(Two Way ANOVA),分别将A、B两组与C组相比,分析小鼠肿瘤体积随时间变化有无统计学差异。
结果:1热电偶监测的消融过程中肿瘤内部最高温度可在消融开始瞬间急剧升高,平均最高温度可达104℃,温度高于43℃肿瘤致死温度持续时间约30s,证明了Na K合金与组织内水接触发生的剧烈放热反应的可靠性及杀灭恶性肿瘤的积极性。红外热像仪监测的消融过程体表温度最高36.2℃,远低于肿瘤中心内部温度,且由消融中心向四周温度递减,为临床中实现微创消融提供依据。
2 A组小鼠消融治疗后肿瘤结构消失,残留空腔结构及血痂,病理切片可见治疗后乳腺癌细胞正常结构消失,细胞发生凝固性坏死,血痂逐渐脱落,局部未见肿瘤复发。B组消融区域同A组,部分残留肿瘤组织继续生长,具有浸润性生长趋势。病理切片可见消融区域与残留肿瘤组织之间存在清晰的界线。C组小鼠肿瘤体积快速增长,浸润周围结构影响活动,C组肿瘤细胞成浸润性生长趋势,病理性核分裂象多见。
3对三组小鼠肿瘤进行持续测量,计算20天小鼠肿瘤体积,将数据进行Two Way ANOVA统计分析,得出两实验组与对照组相比肿瘤体积随时间变化有差异(P=0.0005<0.05),A组C组比较,第1020天两组小鼠肿瘤体积有差异(P<0.05),B组C组比较,第1120天两组小鼠肿瘤体积有差异(P<0.05),即完全消融组及部分消融组小鼠乳腺癌移植瘤体积小于对照组。
参考文献
[1]Current status of hormone therapy in patients with hormone receptor positive(HR+)advanced breast cancer.Elsa Dalmau;;Alejandra Armengol-Alonso;;Montserrat Muñoz;;MiguelÁngel Seguí-Palmer.The Breast,2014
[2]Cryotherapy for Breast Cancer:A Feasibility Study without Excision.Peter J.Littrup;;Bassel Jallad;;Priti Chandiwala-Mody;;Monica D'Agostini;;Barbara A.Adam;;David Bouwman.Journal of Vascular and Interventional Radiology,2009
[3]Injectable liquid alkali alloy based-tumor thermal ablation therapy.Wei Rao;;Jing Liu.Minimally Invasive Therapy&Allied Technologies,2009
[4]Phase II study of capecitabine and trastuzumab combination chemotherapy in patients with HER2 overexpressing metastatic breast cancers resistant to both anthracyclines and taxanes.Takanori Ishida;;Takayoshi Kiba;;Motohiro Takeda;;Kotone Matsuyama;;Satoshi Teramukai;;Ryota Ishiwata;;Norikazu Masuda;;Yuichi Takatsuka;;Shinzaburo Noguchi;;Chikashi Ishioka;;Masanori Fukushima;;Noriaki Ohuchi.Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2009
[5]刘颖.钠钾合金注射式消融方法抗小鼠EMT6乳腺癌细胞移植瘤实验研究[D].河北医科大学,2017.