背景[1-3]
人肺微血管内皮细胞提取于人的肺组织。因在机体多种生理过程和病理变化中起关键作用，其体外培养模型越来越多的应用于相关研究。肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。
人肺微血管内皮细胞
人肺微血管内皮细胞复苏：
1.冻存管从液氮或-80℃冰箱中取出放入PE手套中，迅速没入37℃水浴锅，摇晃冻存管加速溶解，以1min内全部溶解为宜；
2.在超净台中将溶解好的细胞液加入到装有9mL完全培养基的离心管内，1000-1200rpm离心5min，弃去上清液，用1-2mL完全培养基重悬细胞；
3.将细胞悬液加入到含有5-6mL完全培养基的T25瓶中，放入培养箱培养。
人肺微血管内皮细胞传代：
1.将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入1-2mL胰酶替代物（TrypLE™Express）；
2.镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时（可用吸管吸起些许胰酶轻轻吹打细胞层某处，肉眼可见细胞层脱落，即消化完成，否则继续消化），直接吸掉胰酶，加入5-6mL完全培养基，轻轻吹打细胞层，把细胞层吹落，吹散；
3.将细胞悬液按1:2比例分到新的T25瓶中，添加适当的完全培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养；
4.注意培养基pH值变化和细胞密度，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%-90%时，重复传代操作或者冻存。
人肺微血管内皮细胞冻存:
收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例：
1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.
2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
应用[4][5]
人肺微血管内皮细胞可以用于MicroRNA-129-5p在LPS诱导的人肺微血管内皮细胞损伤中的作用和机制研究
探讨miR-129-5p在LPS诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMECs)损伤中的作用及其机制。
方法:1.收集健康志愿者和临床脓毒症患者的血液标本,分离血清,使用RT-qPCR检测血清中miR-129-5p的水平。并收集患者的临床资料进行统计分析。
2. 以HPMECs作为研究对象,使用LPS刺激HPMECs细胞来模拟ARDS时肺血管内皮细胞的损伤效应。10μg/ml LPS分别刺激HPMEC细胞0h、6h、12h、24h和48h,收集细胞提取RNA,RT-qPCR检测细胞中miR-129-5p的表达水平。
3. 将细胞分为对照组(Control)和LPS组,LPS组予以10μg/ml的LPS处理,对照组加入等体积PBS,然后分别加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基进行培养。提取RNA检测miR-129-5p水平,用划痕实验和Transwell实验来评估细胞的迁移能力。
4. 通过Targetscan数据库分析发现,PIK3R1可能是miR-129-5p的靶基因之一,而PIK3R1是PI3K的调节亚基,可以激活PI3K/Akt通路。使用双荧光素酶报告验证miR-129-5p和PIK3R1是否存在结合位点。
5. 使用miR-129-5p模拟物(mimic)及阴性对照(negative control,NC)转染HPMECs。RT-qPCR检测miR-129-5p和PIK3R1 mRNA的表达,ELISA检测炎症因子的水平;同时提取细胞蛋白,用Western blot和免疫荧光检测PIK3R1蛋白水平的表达。通过Transwell和划痕实验分析细胞的迁移能力,RTCA实验分析细胞的增殖能力,流式细胞技术检测凋亡,并检测PI3K/Akt通路蛋白PI3K、Akt、p-Akt的表达情况。
6. 使用PIK3R1小干扰RNA(siRNA)和阴性对照(NC)转染HPMECs。RT-qPCR检测PIK3R1 mRNA的表达,Western blot检测PIK3R1蛋白以及PI3K/Akt信号通路蛋白PI3K、Akt、p-Akt的表达情况。Transwell和划痕实验评估细胞的迁移能力,RTCA实验用于检测细胞增殖。
结果:1.受试者血清中miR-129-5p的表达和正常志愿者相比,脓毒症患者血清中miR-129-5p表达水平明显降低(P<0.05)。脓毒症合并ARDS患者血清中miR-129-5p的表达水平更低(P<0.05)。
2. LPS刺激对HPMECs细胞迁移能力的影响LPS用来刺激HPMECs诱导细胞损伤,miR-129-5p的表达水平降低(P<0.05),且miR-129-5p在24 h时表达水平最低。划痕实验显示,LPS组划痕愈合率低于Control组(P<0.05);Transwell结果表明,和Control组相比,LPS组细胞迁移数目更少(P<0.05)。
3.PIK3R1是miR-129-5p的靶基因双荧光素酶报告显示,miR-129-5p和PIK3R1存在着7个碱基对的结合位点。
参考文献
[1]Non-coding RNAs and Exosomes:Their Role in the Pathogenesis of Sepsis.Seyed MohammadReza Hashemian;;Mohammad Hossein Pourhanifeh;;Sara Fadaei;;Ali Akbar Velayati;;Hamed Mirzaei;;Michael R.Hamblin.Molecular Therapy-Nucleic Acids,2020
[2]MicroRNA-92a serves as a risk factor in sepsis-induced ARDS and regulates apoptosis and cell migration in lipopolysaccharide-induced HPMEC and A549 cell injury.Fan Xu;;Jianghan Yuan;;Shijing Tian;;Yi Chen;;Fachun Zhou.Life Sciences,2020
[3]Cannabis Sativa Revisited—Crosstalk between microRNA Expression,Inflammation,Oxidative Stress,and Endocannabinoid Response System in Critically Ill Patients with Sepsis.Anca Raluca Dinu;;Alexandru Florin Rogobete;;Tiberiu Bratu;;Sonia Elena Popovici;;Ovidiu Horea Bedreag;;Marius Papurica;;Lavinia Melania Bratu;;Dorel Sandesc.Cells,2020
[4]MiR-129-5p sensitization of lung cancer cells to etoposide-induced apoptosis by reducing YWHAB..Xu Chengshan;Du Zhongli;Ren Simei;Liang Xiaoshuan;Li Huihui.Journal of Cancer,2020
[5]袁江汉.MicroRNA-129-5p在LPS诱导的人肺微血管内皮细胞损伤中的作用和机制研究[D].重庆医科大学,2021.