背景[1-3]
小鼠胚胎成骨细胞前体细胞是一种广泛用于成骨细胞学研究的细胞系。该细胞系最早是由美国国立卫生研究院的纳尔逊博士在1970年代初从小鼠胚胎组织中分离出来的。这些细胞具有较强的成骨分化能力，在细胞培养条件下能够分化成成熟的骨细胞，并表达骨特异性基因。因此，小鼠胚胎成骨细胞前体细胞成为了研究骨细胞生物学、骨代谢、骨肉瘤等方面的理想模型。
小鼠胚胎成骨细胞前体细胞
小鼠胚胎成骨细胞前体细胞培养操作:
1)复苏小鼠胚胎成骨细胞前体细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠胚胎成骨细胞前体细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)小鼠胚胎成骨细胞前体细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
小鼠胚胎成骨细胞前体细胞可以用于MicroRNA-92a-1-5p调控小鼠胚胎成骨细胞前体细胞成骨分化的作用机制研究
探究miR-92a-1-5p是否通过Wnt/β3-catenin信号通路调控MC3T3-E1细胞成骨分化,并阐述miR-92a-1-5p发挥调控作用的分子机制。
研究方法1、miR-92a-1-5p在BMP-2诱导MC3T3-E1成骨分化中的影响(1)使用BMP-2诱导MC3T3-E1细胞进行成骨分化,通过qRT-PCR和Western Blot检测诱导前后miR-92a-1-5p、ALP、Runx-2、OSX的表达水平。
(2) 采用MTT法检测诱导前后MC3T3-E1细胞的增殖情况。
(3) 在MC3T3-E1细胞中构建miR-92a-1-5p过表达或低表达模型,采用qRT-PCR检测过表达或干扰效率,以及ALP、Runx-2,OSX的表达情况,采用碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。
(4) 在MC3T3-E1细胞中转染miR-92a-1-5p mimics或inhibitor,再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化7天,通过茜素红S法染色检测成骨分化能力。
2、miR-92a-1-5p调控β-catenin抑制MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制研究(1)结合文献调研、生物信息学和在线数据库分析预测miR-92a-1-5p的下游靶基因。
(2) 在MC3T3-E1细胞中构建miR-92a-1-5p过表达或低表达模型,采用qRT-PCR、Western Blot检测β-catenin的表达水平。
(3) 在MC3T3-E1细胞中转染miR-92a-1-5p mimics,再加入氯化锂(Licl)干预48h,采用qRT-PCR检测细胞中ββ-catenin、ALP、Runx-2、OSX的表达水平。
(4) 在MC3T3-E1细胞中共转染miR-92a-1-5p mimics和GSK-3ββsiRNA,采用qRT-PCR、Western Blot检测β-catenin、Runx-2、ALP、OSX的表达水平。
(5) 在MC3T3-E1细胞中转染miR-92a-1-5p mimics,再加入氯化锂(Licl)干预48h,然后再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化7天,通过ARS染色检测成骨分化能力。
研究结果1、miR-92a-1-5p在BMP-2诱导MC3T3-E1成骨分化中的影响
(1) 使用BMP-2能够成功诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,随着诱导时间的延长,细胞中miR-92a-1-5p的表达水平逐渐下调,而成骨分化相关因子ALP、Runx-2,OSX的mRNA的表达水平逐渐上调。
(2) 诱导后MC3T3-E1细胞的形态为纺锤形、类长梭形或多角形,细胞核变大,但增殖能力比诱导前减弱。
(3) 转染了miR-92a-1-5pmimics后,细胞中成骨分化相关因子ALP、Runx-2,OSX的表达水平明显下调,细胞中ALP的活性也明显减弱;;而转染了miR-92a-1-5p inhibitor后,细胞中成骨分化相关因子ALP、Runx-2,OSX的表达水平明显上调,细胞中ALP的活性增强。
(4) 在MC3T3-E1细胞中转染了miR-92a-1-5p mimics并诱导成骨分化7天后细胞内形成的矿化结节明显减少,而转染了miR-92a-1-5pinhibitor并诱导成骨分化7天后,细胞内形成的矿化结节明显增加。
3、miR-92a-1-5p调控β3-catenin抑制MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制研究
(1) 分析预测结果发现miR-92a-1-5p可以与β-catenin的3’URT区域结合,说明miR-92a-1-5p的下游靶基因是β-catenin。
(2) 转染了miR-92a-1-5p mimics后,细胞中β-catenin的mRNA和蛋白表达水平明显下调;而转染了miR-92a-1-5p inhibitor后,β-catenin的mRNA和蛋白表达水平明显上调。
(3) 在MC3T3-E1细胞中转染了miR-92a-1-5p mimics后,细胞中β-catenin和成骨分化相关因子ALP、Runx-2、OSX的表达水平明显下调,而再加入氯化锂(Licl)干预后,细胞中β-catenin和成骨分化相关因子ALP、Runx-2、OSX的表达水平明显上调,显示Licd可以部分逆转miR-92a-1-5p对细胞中ββ-catenin和成骨分化相关因子表达的抑制作用。
(4) 在MC3T3-E1细胞中共转染了miR-92a-1-5p mimics和si-NC后,细胞中β-catenin、Runx-2蛋白表达水平明显下调,成骨分化相关因子ALP、Runx-2、OSX的mRNA的表达水平也明显下调;而在MC3T3-E1细胞中共转染miR-92a-1-5p mimics和si-GSK-3β后,细胞中ββ-catenin、Runx-2的蛋白表达水平明显上调,成骨分化相关因子ALP、Runx-2、OSX的mRNA的表达水平发生了上调,显示miR-92a-1-5p mimics可能与GSK-3β的作用一样,可以抑制下游靶基因ββ-catenin的表达。
(5) 在MC3T3-E1细胞中成功转染miR-92a-1-5pmimics,再加入氯化锂(Licl)干预48h,然后再诱导成骨分化7天后,与转染miR-92a-1-5p mimics相比,MC3T3-E1细胞成骨分化能力得到了增强。
结论miR-92a-1-5p可以通过Wnt/β-catenin信号通路调控其关键蛋白β-catenin的表达,进而抑制MC3T3-E1细胞中成骨分化关键因子Runx-2、ALP、OSX的表达,最终抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。
参考文献
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[2]miR-383 negatively regulates osteoblastic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in rats by targeting Satb2.Jianfei Tang;;Zeng Zhang;;Xiangyun Jin;;Huipeng Shi.Bone,2018
[3]Human papillomavirus 16 E6 modulates the expression of miR-496 in oropharyngeal cancer.Dayna Mason;;Xiaoying Zhang;;Tânia Monteiro Marques;;Barbara Rose;;Samantha Khoury;;Meredith Hill;;Fiona Deutsch;;J.Guy Lyons;;Margarida Gama-Carvalho;;Nham Tran.Virology,2018
[4]Role of TGF?β1 expressed in bone marrow?derived mesenchymal stem cellsin promoting bone formation in a rabbit femoral defect model.Bing?Yin Sun;;Bao?Xiang Zhao;;Jie?Ying Zhu;;Zheng?Ping Sun;;Yong?An Shi;;Feng Huang.International Journal of Molecular Medicine,2018
[5]林治平.MicroRNA-92a-1-5p调控小鼠胚胎成骨细胞前体细胞成骨分化的作用机制研究[D].南方医科大学,2019.