背景[1-3]
人类鳞状上皮舌癌细胞该细胞来自25岁男性的舌头鳞状细胞癌组织，表皮角蛋白;低水平的整合素，皮下接种了10 7个细胞的裸鼠在21天内以100％的频率（5/5）出现了肿瘤。
人类鳞状上皮舌癌细胞
人类鳞状上皮舌癌细胞培养方法：
1、收到人类鳞状上皮舌癌细胞后，请按照以下方法进行操作：
取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。
2、人类鳞状上皮舌癌细胞传代：
1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，最后放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
4）待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。
3、人类鳞状上皮舌癌细胞冻存：
1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9：1）重悬细胞，并放置于冻存管中；
4）先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。
4、人类鳞状上皮舌癌细胞复苏：
1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2）将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种25cm2培养瓶，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
4）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。
应用[4][5]
人类鳞状上皮舌癌细胞可以用于Bit-1在口腔鳞状细胞癌侵袭、转移及凋亡中作用的初步研究
口腔鳞状细胞癌中Bit-1m RNA和蛋白的表达及其临床意义方法:为了探索Bit-l与口腔鳞状细胞癌的关系,应用了逆转录多聚酶链反应技术(RT-PCR)及免疫组织化学法(Immunohistochemistry)对口腔鳞状细胞癌组织、口腔鳞状细胞癌旁不典型增生组织及口腔正常黏膜组织中Bit-l的表达水平进行检测,从而探讨和研究Bit-1基因及蛋白的表达与口腔鳞状细胞癌的相关性。
1. 首先采用RT-PCR方法检测75例口腔鳞状细胞癌组织(其中有25例患者发生淋巴结转移)及其口腔鳞状细胞癌癌旁组织、口腔黏膜正常组织中Bit-l m RNA表达。
2. 其次本研究采用免疫组织化学(S-P法)检测75例口腔鳞状细胞癌其中25例发生淋巴结转移、25例口腔鳞状细胞癌癌旁组织及25例正常口腔黏膜组织标本中Bit-l蛋白的表达。
实验结果:1.Bit-I m RNA在口腔鳞状细胞癌组织中的表达Bit-l m RNA口腔鳞状细胞癌组织、口腔鳞状细胞癌癌旁组织及正常口腔黏膜组织中的含量依次为0.879±0.136,0.514±0.093,0.438±0.071。Bit-l m RNA在人类口腔鳞状细胞癌组织中的表达水平较口腔鳞状细胞癌癌旁组织及正常口腔黏膜组织(均P<0.05)均高,而其在口腔鳞状细胞癌癌旁组织及正常口腔黏膜中的表达无显著性差异。
3. Bit-l m RNA的表达与临床病理学参数的关系统计学结果表明,在口腔鳞状细胞癌组织中,Bit-1的表达水平与患者的年龄、性别无明显相关(P>0.05),但Bit-l基因的表达在有淋巴结转移组中明显高于无淋巴结转移组,两组间比较有统计学意义。而且在TNM分期中III/IV期组表达水平明显高于I/II期组,并且具有统计学意义(P<0.05)。
4. Bit-l蛋白在口腔黏膜组织中的表达通过免疫组化实验检测Bit-1在口腔鳞状细胞癌原发灶及正常口腔黏膜的表达情况。Bit-1主要表达于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜,在正常口腔黏膜中均呈低染色或不染色。
实验结果显示:在75例口腔鳞状细胞癌原发灶中阳性表达54例(72%),而在25例正常口腔黏膜阳性表达仅2例(8%),统计分析表明Bit-1在两组间表达具有显著性差异(P<0.05)。4.Bit-l蛋白的表达与临床病理学参数的关系结合标本的病理学诊断、HE染色结果及手术记录,对所有标本按照分化程度、性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移等进行分类,并进行统计学分析结果表明:
在Ⅰ-Ⅱ期的口腔鳞状细胞癌原发灶的Bit-1阳性表达24例(24/40),而Ⅲ-Ⅳ期口腔鳞状细胞癌原发灶Bit-1阳性表达30例(30/35),明显高于前者的表达,两组比较有统计学意义。
伴有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中Bit-1阳性表达21例(21/25),不伴有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中Bit-1阳性表达33例(33/50),伴有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中Bit-1的表达明显高于不伴有淋巴结转移组的表达,两组间有统计学意义(P<0.05)。
统计分析结果显示:Bit-1表达与口腔鳞状细胞癌的TNM分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05),而与患者的性别、年龄、肿瘤大小,分化程度无明显关系(P>0.05)。
参考文献
[1]Implications of Bit1 and AIF overexpressions in esophageal squamous cell carcinoma.Tianli Fan;;Fang Tian;;Shanyong Yi;;Yang Ke;;Shengna Han;;Lirong Zhang;;Hongtao Liu.Tumor Biology,2014
[2]Bit1 in anoikis resistance and tumor metastasis.Scott Jenning;;Tri Pham;;Shubha Kale Ireland;;Erkki Ruoslahti;;Hector Biliran.Cancer Letters,2013
[3]Cancer Statistics,2001.Robert T.Greenlee;Mary BethHill‐Harmon;TaylorMurray;MichaelThun.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2009
[4]Motility‐Related Proteins as Markers for Head and Neck Squamous Cell Cancer.Manoj T.Abraham;M.AbrahamKuriakose;Peter G.Sacks;HermanYee;LuisChiriboga;Elaine L.Bearer;Mark D.Delacure.The Laryngoscope,2009
[5]李文鹿.Bit-1在口腔鳞状细胞癌侵袭、转移及凋亡中作用的初步研究[D].郑州大学,2017.