背景[1-3]
SNB-19人胶质瘤贴壁细胞系来源于1980年手术切除的一名47岁男性的左侧顶枕叶胶质母细胞瘤；文献中描述该细胞可分泌纤溶酶原激活剂，在软琼脂中可克隆，在裸鼠中可致瘤；DNA指纹图谱明确表明SNB-19是星形细胞瘤细胞系U-251 MG的亚克隆。（STR检测位点同U-251MG)。
SNB-19人胶质瘤贴壁细胞系
SNB-19人胶质瘤贴壁细胞系细胞培养操作
1）复苏SNB-19人胶质瘤贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）SNB-19人胶质瘤贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）SNB-19人胶质瘤贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
SNB-19人胶质瘤贴壁细胞系可以用于miR-218对胶质瘤抑瘤作用及其机制的研究
研究旨在观察miR-218在恶性胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及诱导细胞成熟分化方面的作用,证实CDK6是否miR-218的天然靶基因,探讨miR-218特异性敲低CDK6表达是否是该miRNA发挥抑瘤作用的分子机制。
[方法]①通过质粒转染和G418筛选建立过表达miR-218的U87MG和SNB-19亚细胞系及对照亚细胞系,采用stem-loop qRT-PCR比较各亚细胞系中miR-218的表达水平。
②采用荧光素酶实验、qRT-PCR及Western blot验证CDK6是否是miR-218的天然靶基因,探讨miR-218敲低CDK6表达的机制。
③利用Ki-67免疫细胞化学染色及克隆形成实验比较各亚细胞系细胞增殖活性,通过流式细胞术(FCM)和cyclin D1、cyclin E、cyclin A、CDK4、CDK6等细胞周期调节蛋白的Western blot检测比较各亚细胞系细胞周期分布情况,分析miR-218诱导细胞周期阻滞和增殖抑制的分子机制。
④通过Caspase3/7活性检测及FCM比较miR-218过表达亚细胞系及miR-218mimics转染细胞凋亡水平的改变,通过质粒转染补充外源性CDK6,观察CDK6对miR-218促凋亡作用的影响,以进一步验证miR-218特异性下调CDK6表达在其促凋亡作用中的意义。
⑤利用体外迁移侵袭实验、Matrigel3D培养及定量侵袭实验比较miR-218表达水平不同亚细胞系迁移侵袭能力的差异,通过补充外源性CDK6探讨特异性敲低CDK6是否是miR-218抑制肿瘤细胞迁移侵袭的分子机制。
⑥利用Western blot及免疫细胞化学染色检测不同亚细胞系CD133、Nestin及GFAP表达的差异,观察miR-218在恶性胶质瘤细胞系及胶质瘤干细胞(GSCs)成熟分化中的作用；利用免疫荧光观察miR-218下调CD133及Nestin表达的特异性；通过观察补充外源性CDK6对miR-218促分化作用的影响探讨特异性敲低CDK6是否是miR-218促进肿瘤细胞成熟分化的分子机制。
[结果]①成功构建了过表达miR-218的U87MG及SNB-19胶质母细胞瘤亚细胞系,并经stem-loop qRT-PCR证实其miR-218的表达量分别是对照亚细胞系的11.58±2.39倍及26.23±8.08倍。
②荧光素酶实验结果显示,miR-218可通过与荧光素酶mRNA下游连接的CDK63’UTR结合,特异性降低荧光素酶的表达水平,证实CDK6是miR-218的天然靶基因；qRT-PCR及Western blot结果显示,miR-218过表达亚细胞系CDK6mRNA及蛋白表达水平均明显低于对照亚细胞系。
③miR-218过表达亚细胞系Ki-67阳性标记指数(LI)和克隆形成效率均明显低于对照亚细胞系,其cyclin D1表达水平明显高于对照亚细胞系,cyclin E、cyclin A表达水平明显低于后者,而CDK4的表达水平无明显差异；FCM结果显示,miR-218过表达亚细胞系G1期细胞比例增高,而S期及G2／M期细胞比例相应减少。
④miR-218过表达亚细胞系Caspase3/7活性明显高于对照亚细胞系,miR-218mimics转染的U87MG及SNB-19细胞其凋亡指数明显高于无义对照序列转染细胞。外源性CDK6不能降低miR-218过表达亚细胞系的Caspase3/7活性及miR-218mimics转染细胞的凋亡指数。
⑤迁移、侵袭实验结果及3D培养结果均显示,miR-218可有效抑制胶质母细胞瘤细胞系的迁移和侵袭能力,外源性CDK6可部分逆转miR-218对肿瘤细胞迁移侵袭的影响。
⑥miR-218过表达亚细胞系中CD133及Nestin表达水平明显低于对照亚细胞系,而GFAP LI明显高于后者。外源性CDK6可部分逆转miR-218过表达造成的上述蛋白的表达变化；免疫荧光检测显示,CD133和Nestin表达降低特异性地发生于成功转染miR-218表达质粒且表达EGFP报导基因的肿瘤细胞。
参考文献
[1]MicroRNAs and glioblastoma:roles in core signalling pathways and potential clinical implications..Sana Jiri;;Hajduch Marian;;Michalek Jaroslav;;Vyzula Rostislav;;Slaby Ondrej.Journal of cellular and molecular medicine,2011
[2]Blockade of the NFκB pathway drives differentiating glioblastoma-initiating cells into senescence both in vitro and in vivo..Nogueira L;;Ruiz-Ontañon P;;Vazquez-Barquero A;;Lafarga M;;Berciano M T;;Aldaz B;;Grande L;;Casafont I;;Segura V;;Robles E F;;Suarez D;;Garcia L F;;Martinez-Climent J A;;Fernandez-Luna J L.Oncogene,2011
[3]Genome-wide expression profiling identifies deregulated miRNAs in malignant astrocytoma..Rao Soumya A M;;Santosh Vani;;Somasundaram Kumaravel.Modern pathology:an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology,Inc,2010
[4]More than markers:biological significance of cancer stem cell-defining molecules..Keysar Stephen B;;Jimeno Antonio.Molecular cancer therapeutics,2010
[5]孔妍玲.miR-218对胶质瘤抑瘤作用及其机制的研究[D].天津医科大学,2013