背景[1-3]
大鼠乳腺上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。大鼠乳腺上皮细胞经Cytokeratin-18（CK18）或PCK(Pan Cytokeratin)免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，细胞活性良好，不含细菌、真菌、支原体、传染性病毒等。
大鼠乳腺上皮细胞
大鼠乳腺上皮细胞培养方法：
1、收到大鼠乳腺上皮细胞后，请按照以下方法进行操作：
取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。
2、大鼠乳腺上皮细胞传代：
1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，最后放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
4）待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。
3、大鼠乳腺上皮细胞冻存：
1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9：1）重悬细胞，并放置于冻存管中；
4）先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。
4、大鼠乳腺上皮细胞复苏：
1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2）将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3）弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种25cm2培养瓶，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
4）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。
应用[4][5]
大鼠乳腺上皮细胞可以用于当归芍药散加味对乳腺增生模型大鼠乳腺上皮细胞let-7、p-ERK表达的影响研究
通过动物实验研究当归芍药散加味方对乳腺增生大鼠乳腺上皮细胞p-ERK、let-7基因表达的影响,并对大鼠乳腺组织进行病理学观察,探讨当归芍药散加味方对乳腺上皮细胞的转化、增值分化及凋亡的影响,为中医药从调理肝脾法治疗乳腺增生病及防治乳腺癌提供一定的科学依据。
方法:SD雌性未孕健康大鼠72只,体重180-200克,通过自由饮水进食、自然光照,适应环境1周后,如无异常表现,采用分层随机法,将72只大鼠随机分为空白对照组16只,实验组56只。除空白对照组外,其余各组大鼠采用雌、孕激素联合造模,一个月后,实验组大鼠再随机分为模型1组、模型2组、乳癖消组、当归芍药散加味组,每组14只。同时处死模型1组大鼠,并将其第2、3对乳房完整剥离做病理切片,置于高倍显微镜下观察其组织学变化,以确定大鼠乳腺增生病理模型是否成功。
造模成功后,治疗组予以当归芍药散加味生药提取液灌服,剂量10ml/kg/天,连续30天;治疗对照组以0.3g/kg乳癖消混悬液灌服,连续30天;空白组对照组和模型2组分别以生理盐水灌胃,剂量10ml/kg/天,连续30天。连续灌胃一个月后,观察各组大鼠一般情况,处死全部实验大鼠并留取大鼠乳腺组织标本,测量大鼠乳头直径及高度变化;免疫组化法测定各组实验动物乳腺上皮细胞let-7基因表达与p-ERK蛋白表达,比较其差异性;对各组实验动物乳腺病理组织学进行比较分析。
结果:模型组、乳癖消组、当归芍药散加味组的大鼠乳头直径、高度均大于空白组,差异非常显著,P<0.01;乳癖消组及当归芍药散加味组大鼠乳头直径、高度均小于模型组,差异非常显著,P<0.01;乳癖消组与当归芍药散加味组大鼠乳头直径、高度无显著性差异,P>0.05。模型组、乳癖消组、当归芍药散加味组的大鼠p-ERK基因表达量均大于空白组,差异非常显著,P<0.01;乳癖消组及当归芍药散加味组大鼠p-ERK基因表达量均小于模型组,差异非常显著,P<0.01;当归芍药散加味组p-ERK基因表达量低于乳癖消组,差异非常显著,P<0.01;模型组、乳癖消组、当归芍药散加味组的大鼠let-7基因表达量均小于空白组,差异非常显著,P<0.01;乳癖消组及当归芍药散加味组大鼠let-7基因表达量均大于模型组,差异非常显著,P<0.01;当归芍药散加味组let-7基因表达量高于乳癖消组,差异非常显著,P<0.01;
结论:当归芍药散加味方可减轻大鼠乳腺增生、肿大状态,改善局部乳腺组织水肿,达到减轻乳腺增生的作用,同时对乳腺增生上皮细胞有促进let-7基因表达、抑制p-ERK蛋白表达的作用,进而抑制细胞增殖、分化,促进细胞凋亡,改善乳腺组织增生状态。其机理可能是当归芍药散加味方具有养血疏肝,利湿健脾,活血散结之功效,可调节机体气血阴阳的动态平衡,从而达到治疗和改善乳腺增生病的目的。
参考文献
[1]Protection of bleomycin-induced fibrosis and inflammation by taurine.Georgia Schuller-Levis;;Ronald E.Gordon;;Chuanhua Wang;;Seung Yong Park;;Eunkyue Park.International Immunopharmacology,2009
[2]MRSA Breast Abscesses in Postpartum Women.E.W.L.Chuwa;;C.M.Y.Wong;;Y.Y.Tan;;G.S.Hong.Asian Journal of Surgery,2009
[3]Taurine protects rat testes against NaAsO 2-induced oxidative stress and apoptosis via mitochondrial dependent and independent pathways.Joydeep Das;;Jyotirmoy Ghosh;;Prasenjit Manna;;Mahua Sinha;;Parames C.Sil.Toxicology Letters,2009
[4]Induction of lactoferrin gene expression by innate immune stimuli in mouse mammary epithelial HC-11 cells.Yin Li;;Gino V.Limmon;;Farhad Imani;;Christina Teng.Biochimie,2008
[5]王婷.当归芍药散加味对乳腺增生模型大鼠乳腺上皮细胞let-7、p-ERK表达的影响研究[D].福建中医药大学,2018.