背景[1-3]
MuM-2C是一种人侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞，也称为MUM-2C、MUM2C或Mum2C。它的来源是皮肤，属于肿瘤细胞，形态为多角形，生长特性为贴壁生长。
MuM-2C
MUM-2C人侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞培养操作
1）复苏MuM-2C细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）MuM-2C细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）MuM-2C细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
MuM-2C可以用于SKA1在葡萄膜黑色素瘤中的表达及生物学意义
研究纺锤体动粒相关复合体-1(Spindle and kinetochore associated complex-1,SKA1)在葡萄膜黑色素瘤(Uveal Melanoma,UM)组织中的表达,以及在UM发生发展过程中的作用及分子机制,为临床以SKA1为靶点UM精准治疗提供科学依据。
方法1、以免疫组化法检测20例福尔马林固定-石蜡包埋UM组织中SKA1的表达水平,并分析SKA1与临床病理特征及生存预后的关系;同时,利用生物信息学方法,分析癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中UM病例组织中SKA1表达、与预后及临床病理特征的关系,佐证课题组研究结果的可靠性。
2、采用实时荧光定量PCR(Quantitive Real Time PCR,q RT-PCR)检测A-375、MUM-2B和MUM-2C黑色素瘤细胞株中SKA1的表达,筛选SKA1高表达细胞株作为工具细胞,再以SKA1干扰慢病毒感染工具细胞,以无义序列作为阴性对照(sh Ctrl),q RT-PCR检测各处理组细胞中SKA1表达,筛选有效干扰序列,用于后续细胞表型研究。
3、以SKA1干扰慢病毒感染工具细胞,以无义序列作为阴性对照,再采用MTT法、流式细胞技术及Caspase3/7法检测增殖、凋亡相关蛋白,研究SKA1敲减后,细胞增殖、凋亡生物学活性的变化,明确SKA1在UM发生发展过程中的具体作用。
4、利用TCGA数据库中UM病例,根据SKA1表达中位值分为高、低表达两组,再采用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)的方法,分析SKA1调控UM发生发展的信号通路。
结果1、SKA1在UM肿瘤组织、癌旁组织的表达无统计学差异(P>0.05)。TCGA生信分析结果显示,SKA1高表达的患者,总生存率(Overall survival,OS)显著下降(P=0.021,HR=2.55,95%CI:0.92-7.05)。
2、SKA1在A-375、MUM-2B和MUM-2C黑色素瘤细胞株中表达丰度均高。与阴性对照组相比,sh SKA1-1、sh SKA1-2、sh SKA1-3处理组的敲减效率分别为78.86%、62.71%、57.83%。
3、以sh SKA1-1干扰慢病毒感染MUM-2B工具细胞,与sh Ctrl组相比,sh SKA1-1干扰组490 nm OD值显著降低(P<0.05),sh SKA1-1干扰组凋亡细胞比例显著升高(P<0.05),sh SKA1-1干扰组荧光强度显著升高(P<0.05)。
4、GSEA分析显示,SKA1高表达,与细胞周期、减数分裂、损伤修复、核苷酸代谢、DNA复制及肿瘤发生相关的信号通路有关。结论实验研究及生信分析结果显示,SKA1在UM组织中呈高表达,其高表达是影响UM预后的不良因素;SKA1可能通过促进细胞周期转化,抑制凋亡,进而促进UM发生发展。
参考文献
[1]Recent advances in understanding the role of Cdk1 in the Spindle Assembly Checkpoint..Serpico Angela Flavia;;Grieco Domenico.F1000Research,2020
[2]Direct Phosphorylation and Stabilization of MYC by Aurora B Kinase Promote T-cell Leukemogenesis.Jue Jiang;;Jingchao Wang;;Ming Yue;;Xiaolian Cai;;Tianci Wang;;Chao Wu;;Hexiu Su;;Yanwu Wang;;Meng Han;;Yingchi Zhang;;Xiaofan Zhu;;Peng Jiang;;Peng Li;;Yonghua Sun;;Wuhan Xiao;;Hui Feng;;Guoliang Qing;;Hudan Liu.Cancer Cell,2020
[3]Too MAD or not MAD enough:The duplicitous role of the spindle assembly checkpoint protein MAD2 in cancer.Mark Bates;;Fiona Furlong;;Michael F.Gallagher;;Cathy D.Spillane;;Amanda McCann;;Sharon O'Toole;;John J.O'Leary.Cancer Letters,2020
[4]SKA1 promotes malignant phenotype and progression of glioma via multiple signaling pathways..Wang Xizhao;;Zeng Yu;;Zhou Mingfeng;;Zhang Xian;;Xu Anqi;;Lin Jie;;Wu Zhiyong;;Xie Cheng;;Luo Jie;;Ding Shengfeng;;Zhan Zhengming;;Long Hao;;Song Ye.Cancer cell international,2019
[5]凌峰.SKA1在葡萄膜黑色素瘤中的表达及生物学意义[D].内蒙古医科大学,2021.