背景[1-3]
兔脂肪干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞，主要从脂肪组织中分离得到。在组织工程领域中，脂肪干细胞因其来源丰富、取材容易、增殖能力强等特点，受到越来越多的关注。这些干细胞可以分化为多种细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、上皮细胞等，具有多向分化潜能。
在一定的诱导条件下，兔脂肪干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等，具有促进组织再生和修复的能力。这些干细胞也可以用于治疗一些疾病，如修复组织损伤、治疗缺血性疾病等。此外，脂肪干细胞的移植还可以改善早衰、亚健康等疾病，提高身体的免疫力。
兔脂肪干细胞
兔脂肪干细胞培养操作
1.复苏兔脂肪干细胞：将含有细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2.兔脂肪干细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
（1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
（2）加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
（3）按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
（4）将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3.细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
（1）兔脂肪干细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰1酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
（2）4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
（3）将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
兔脂肪干细胞可以用于止痛健骨方对兔脂肪干细胞向成骨细胞分化、增殖的影响
通过大兔腹股沟处脂肪提取兔脂肪干细胞(Rabbit adipose stem cells,RADSCs),并进行体外培养,培养至数代后,检测其增殖、向成骨分化的能力,证明其具有脂肪干细胞的特性。在前期提取细胞实验的基础上,通过分离、培养兔脂肪干细胞,制备止痛健骨方含药血清,并将其分为对照组、实验组诱导其向成骨分化,观察止痛健骨方对骨形成蛋白-7(Bone morphogenetic protein,BMP-7)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)以及对脂肪干细胞增殖能力的影响,为止痛健骨方治疗股骨头坏死提供科学的实验依据,具有重要的应用前景和科学价值。
方法:切取适量兔腹股沟处的脂肪组织,用PBS反复冲洗并去除多余组织后,用I型胶原酶消化,分离、重悬待细胞贴壁后培养至第2代,随后加入CD44、CD90抗体,用流式细胞术检测其相应的表面抗原表达;使用成骨、成脂诱导液诱导细胞分化,并用茜素红染色、油红O染色检测,判定细胞为RADSCs。用止痛健骨方对大兔连续7天灌胃,最后一天灌胃后麻醉,随即腹主动脉取血,制备含药血清,制成0%、5%、10%、15%和20%五个浓度的含药血清,设置同样浓度的空白血清。细胞分为对照组、空白血清组、含药血清组,加入相应血清后,用CCK-8法检测细胞增殖的情况。三组各加入成骨诱导液后,用ELISA法检测ALP、BMP-7的表达浓度,绘制图形,解读不同浓度血清、含药血清对细胞向成骨分化的影响,并确认诱导浓度。
结果:用I型胶原酶消化、分离、接种细胞后,分离至第2代,随后加入CD44、CD90抗体,用流式细胞术检测到细胞表面抗原CD44、CD90表达呈阳性;用成骨、成脂诱导液诱导细胞分化后,行茜素红染色、油红O染色,结果为阳性,表明细胞为RADSCs。
用不同浓度的血清、含药血清培养细胞后,CCK-8法检测ADSCs增值率,观测到各组培养至24小时时,各组差异无明显差异(P>0.05),而含药血清10%组细胞在培养48、72小时后相对增值率最高,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),故含药血清使ADSCs增殖浓度为10%。各组ADSCs细胞培养21天后,与空白对照组比较,止痛健骨方含药血清各组ADSCs细胞BMP-7含量及ALP活力均增加(P<0.01);
与空白血清-5%组比较,止痛健骨方含药血清各组ADSCs细胞BMP-7含量(P<0.01)及ALP活力均不同程度增加(P<0.05);与含药血清-10%组比较,止痛健骨方含药血清-20%组ADSCs细胞BMP-7含量(P<0.01)及ALP活力均增加(P<0.05),止痛健骨方含药血清-5%组ADSCs细胞BMP-7含量及ALP活力均降低(P<0.05)。提示止痛健骨方含药血清可明显增加ADSCs细胞BMP-7含量及ALP活力,且含药血清浓度在10%和20%时效果更加显著。
结论:本实验成功从兔腹股沟处脂肪中提取、分离、培养出RADSCs,在体外有增殖能力和向成骨、成脂分化的能力。
参考文献
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